《Microorganisms》：Source Tracking and Functional Prediction of Microbial Communities in Initial Jiupei of Fen-Flavor Baijiu: Daqu-Dominated Sourcing with Measurable Environmental Inputs
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：理解初始发酵酒醅（Jiupei）的微生物来源对于提升清香型白酒（Fen-flavor Baijiu）工艺一致性具有重要意义，然而大曲（Daqu）与生产环境对酒醅微生物群落的相对贡献尚未得到充分解析。本研究采用高通量测序（high-throughput seq
：理解初始发酵酒醅（Jiupei）的微生物来源对于提升清香型白酒（Fen-flavor Baijiu）工艺一致性具有重要意义，然而大曲（Daqu）与生产环境对酒醅微生物群落的相对贡献尚未得到充分解析。本研究采用高通量测序（high-throughput sequencing）、群落排序（community ordination）、SourceTracker分析、共现网络分析（co-occurrence network analysis）及基于PICRUSt2的功能预测，对初始酒醅（JP0d）、大曲及代表性环境储库中的细菌和真菌群落进行了表征。研究结果表明，大曲被推断为优势来源，贡献了87.1%的细菌群落和90.1%的真菌群落。环境储库提供了较小但可检测的输入：发酵车间空气（FJSKQ）贡献了2.53%的细菌群落，设备表面贡献了1.1–5.1%的细菌群落，而工具（GJ）、冷却输送带（LSJ）和蒸馏设备表面（ZT）贡献了1.5–3.2%的真菌群落。JP0d与JP28d之间的相关性在细菌群落中（r = 0.46）高于真菌群落（r = 0.39），表明在该数据集中细菌群落的终点组成相似性更高。功能预测识别出JP0d细菌群落中与氨基酸和碳水化合物代谢、膜转运、翻译、复制和修复相关的显著通路。上述结果支持初始酒醅微生物群落以大曲为主导的来源模型，并表明生产环境可作为清香型白酒发酵中补充性微生物储库。该研究为管理开放式固态发酵系统提供了微生物溯源框架。
论文解读文章
一、研究背景与问题
白酒是中国以谷物为底物进行固态发酵生产的蒸馏酒，混合微生物群落在乙醇和风味物质形成中发挥关键作用。清香型（轻香型）白酒以大曲作为糖化发酵剂，在陶瓷发酵缸中进行发酵。大曲为糖化和发酵提供微生物和酶类，其组成随制曲工艺和类型的不同而变化。由于粮醅冷却、拌料、转运及入缸等工序使底物暴露于生产环境中，初始发酵酒醅中的微生物群落可能同时反映大曲和生产界面的输入。识别这些潜在输入有助于指导微生物监测的重点方向，尽管群落谱图本身不能确立对产品质量的影响。
已有研究从不同角度提供了重要但侧重点各异的证据。Pang等（2018）考察了清香型白酒不同生产时期的环境微生物群、发酵群落及风味特征；针对汾香型酒醅的研究描述了时间尺度上的微生物变化和功能谱；近期对不同地区大曲的比较研究则表征了起始群落和代谢性状的差异。在其他白酒体系中，Gong等（2025）追踪了环境对酱香型大曲的贡献；Cheng等（2024）研究了复合香型酒醅的微生物来源和演替；Tang等考察了麸曲型白酒入窖前后的微生物来源；Bo等（2024）开发了基于PMA的方法以表征酒醅中的活体微生物群落。这些研究确立了酒曲和环境微生物群的相关性，但在香型、发酵阶段、采样源集或核心分析问题上存在差异。然而，已有研究尚未定量解析清香型白酒初始发酵阶段大曲与环境来源的相对贡献，尤其是细菌和真菌群落的不同组装模式。
本研究聚焦于正常清香型白酒发酵过程中的初始酒醅，将其细菌和真菌群落与大曲及生产线代表性环境样品进行比较。采用高通量测序表征微生物多样性和群落组成，应用SourceTracker估算潜在来源对初始酒醅的比例贡献，通过初始酒醅与后期发酵阶段的相关性分析评估细菌和真菌群落在时间点上的组成相似程度，最后利用共现网络分析和PICRUSt2功能预测探索初始酒醅中潜在的微生物关联和功能谱。虽然来源追踪方法已应用于其他白酒香型，但清香型白酒初始酒醅的微生物来源结构尚未被定量解析，大曲与环境储库对初始酒醅的相对贡献以及这些贡献在细菌和真菌群落之间是否存在差异仍属未知。本研究填补了这一空白，首次对清香型白酒初始酒醅进行了定量来源追踪分析。
二、研究内容与主要结论
研究人员在山西省杏花村汾酒厂进行了采样。初始酒醅样品在元排期（每年九月夏季停产结束后开始至停产前最后阶段的稳定生产时期）常规清香型白酒发酵第0天采集，并在发酵第3、7、11、15、21、24和28天额外采集酒醅样品用于时间演替分析。同一批次对应的大曲样品也被采集。环境样品在发酵启动前立即采集，包括生产工具、棉被、粮醅冷却输送带、甑桶、地面、发酵缸边缘、发酵缸内壁及邻近土壤。发酵车间空气微生物通过Sartorius MD8空气采样器采集至明胶滤膜上。所有样品无菌包装、冰上运输并保存于?80 °C直至DNA提取。
研究得出以下主要结论：大曲被推断为初始酒醅微生物群落的优势来源，贡献了87.1%的细菌群落和90.1%的真菌群落；环境储库提供了较小但可检测的输入，其中发酵车间空气贡献了2.53%的细菌群落，设备表面贡献了1.1–5.1%的细菌群落，工具、冷却输送带和蒸馏设备表面贡献了1.5–3.2%的真菌群落；初始酒醅与第28天酒醅之间的相关性在细菌群落中（r = 0.46）高于真菌群落（r = 0.39）。功能预测识别出初始酒醅细菌群落中与氨基酸和碳水化合物代谢、膜转运、翻译、复制和修复相关的显著通路。这些结果支持初始酒醅微生物群落以大曲为主导的来源模型，表明生产环境可作为清香型白酒发酵的补充性微生物储库，为管理开放式固态发酵系统提供了微生物溯源框架。
三、主要关键技术方法
研究人员采用以下关键技术方法开展研究：高通量测序技术，分别扩增16S rRNA基因V4区（515-F/806-R引物）和ITS区（ITS-1F/ITS-2R引物），在Illumina HiSeq 4000平台测序；基于QIIME2的扩增子序列变异（ASV）分析，细菌采用SILVA数据库（版本138.2）、真菌采用UNITE数据库（版本9.0）进行分类学注释；加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）和层次聚类分析（HCA）；SourceTracker（版本0.9.8）来源追踪分析；Spearman秩相关的共现网络分析；PICRUSt2（版本2.5.0）功能预测并映射至KEGG通路。样本来源为山西省杏花村汾酒厂，每个时间点采集三个独立发酵缸作为生物学重复。
四、研究结果
- 1.
微生物Alpha多样性在大曲、初始酒醅和环境储库之间存在差异
稀释曲线达到饱和表明测序深度足以进行多样性分析。土壤组细菌丰富度最高，平均1707个观察ASV，显著高于其他组（p < 0.01）；工具组细菌丰富度最低（292个ASV），大曲和初始酒醅分别含757和320个ASV，两者差异显著（p < 0.05）。真菌丰富度在大曲（82个ASV）和初始酒醅（77个ASV）中最低，均显著低于环境组（p < 0.05）。Shannon指数方面，细菌在土壤中最高，真菌在发酵缸内壁和棉被中最高。环境储库尤其是土壤含有更多样化的微生物群落，而大曲和初始酒醅在发酵开始时群落丰富度较低。
- 2.
细菌群落在大曲与初始酒醅之间呈现相似性并在生产表面趋于趋同
优势细菌门为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidota）。厚壁菌门在多数样品中占主导，在工具、甑桶、地面、发酵缸边缘、大曲和初始酒醅中相对丰度超过50%。属水平上，乳酸杆菌属（Lactobacillus）在多个生产表面丰度较高（超过70%），但在大曲和初始酒醅中丰度较低。PCoA显示大曲和初始酒醅形成紧密但可区分的聚类，表明细菌群落结构相似。HCA将样品分为三大分支：初始酒醅与大曲聚为一支，空气与土壤聚为一支，其余环境样品聚为一支。大曲与初始酒醅的相似性支持大曲作为主要初始接种物的作用，而发酵缸相关样品的聚类表明生产环境在开放发酵系统中可能提供补充性微生物输入。
- 3.
真菌群落以子囊菌门为主并呈现储库特异性模式
子囊菌门（Ascomycota）在所有样品中占主导，相对丰度超过80%，在大曲中达97.6%。属水平上，复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）和伊萨酵母属（Issatchenkia）在初始酒醅和大曲中占优势，合计占真菌群落的75%以上。枝孢属（Cladosporium）在地面富集（28.8%），威克汉姆酵母属（Wickerhamomyces）在发酵缸边缘和内壁分别达14.6%和10.8%，但在初始酒醅中仅占0.3%。真菌PCoA中，大曲和初始酒醅占据邻近位置，土壤与之分离。复膜孢酵母属和伊萨酵母属是白酒生产中重要的功能真菌，与淀粉降解和乙醇产生相关。
- 4.
SourceTracker分析确定大曲为初始酒醅微生物群落的优势推断来源
发酵过程中，乳酸杆菌属在细菌群落中逐渐占主导并趋向中后期增加；魏斯氏菌属（Weissella）和明串珠菌属（Leuconostoc）主要出现在发酵早期后减少。真菌群落中，复膜孢酵母属和伊萨酵母属在初始酒醅中占优势，伊萨酵母属在发酵中保持相对稳定，复膜孢酵母属减少而威克汉姆酵母属在后期增加。相关性分析显示，细菌群落中初始酒醅与大曲的相关性（r = 0.47）高于环境拭子样品（r = 0.18–0.26），初始酒醅与第28天酒醅的相关性为r = 0.46；真菌群落中大曲与初始酒醅的相关性最高（r = 0.52），初始酒醅与第28天酒醅的相关性为r = 0.39。SourceTracker分析估算大曲贡献了87.1%的细菌和90.1%的真菌群落。属水平上，双歧杆菌属（Bifidobacterium）、粪球菌属（Coprococcus）、另枝菌属（Alistipes）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）几乎完全来源于大曲（≥99%），而布劳特氏菌属（Blautia）、副拟杆菌属（Parabacteroides）和瘤胃球菌属（Ruminococcus）的主要来源也是大曲（66.8–74.4%）并伴有少量环境输入。真菌中复膜孢酵母属和伊萨酵母属主要来源于大曲，而根霉属（Rhizopus）和横梗霉属（Lichtheimia）从工具、冷却输送带和甑桶获得可观贡献。
- 5.
初始酒醅微生物组的共现网络与预测功能潜力
共现网络包含23个节点和78条边，其中44条正相关和34条负相关，正相关占56.96%，负相关占43.04%。复膜孢酵母属、威克汉姆酵母属和根霉属之间呈正相关，而这三个真菌属与Fusicatenibacter和Subdoligranulum呈负相关。PICRUSt2功能预测表明代谢相关通路是最丰富的预测功能类别，氨基酸和碳水化合物代谢在预测代谢通路中突出，膜转运是环境信息处理中最丰富的次级通路，翻译、复制和修复相关通路在遗传信息处理中也较突出。这些预测谱表明初始酒醅中的细菌群落具有底物利用、营养转运和生长相关过程的潜力。
五、讨论与结论
讨论部分指出，来源追踪结果解释了为何多个环境储库的更大多样性并未转化为对初始酒醅的相当贡献。大曲占推断细菌和真菌来源的大部分，与其与初始粮醅的紧密组成相似性一致。环境信号较小且在空气和生产界面之间变化，表明这些储库对初始群落的贡献程度不同。Pang等（2018）曾报道生产界面存在丰富微生物并考察了其与清香型白酒发酵的关联，本研究的来源估算为发酵起点提供了定量视角。功能预测中碳水化合物和氨基酸代谢的突出地位与谷物底物及正在建立的发酵群落的代谢需求一致，Huang等（2020）通过宏基因组测序观察到清香型白酒发酵早期碳水化合物和氨基酸转运及代谢相关基因的增加，为初始酒醅的功能谱提供了发酵阶段比较。
结论部分指出，本研究考察了清香型白酒发酵中初始酒醅的微生物来源，确定大曲为优势来源，贡献了87.1%的细菌群落和90.1%的真菌群落，同时环境储库（主要为空气和设备表面）提供了较小的推断贡献。这些发现推进了对开放式固态发酵系统中微生物组装的理解，对白酒酿造行业的质量控制和工艺一致性具有实际价值，该溯源框架也可能适用于其他传统固态发酵产业如黄酒和食醋生产。未来结合分离株层面的技术功能和生物安全表征与最终产品化学和感官分析的研究，将有助于将初始微生物来源与酒曲潜力和最终白酒质量联系起来。
