《Microorganisms》：Isolation, Identification and Genomic Characterization of Carbamazepine-Tolerant Bacteria from Contaminated Aquatic Environments
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水生环境中的药品污染已引起人们对能够耐受这些化合物的微生物及其耐受机制的兴趣。本研究从厄瓜多尔基多马钱加拉河（Machángara River）的污染水体中分离并表征了耐卡马西平（carbamazepine, CBZ）细菌，并对耐受性最强的分离株进行了基因组研
水生环境中的药品污染已引起人们对能够耐受这些化合物的微生物及其耐受机制的兴趣。本研究从厄瓜多尔基多马钱加拉河（Machángara River）的污染水体中分离并表征了耐卡马西平（carbamazepine, CBZ）细菌，并对耐受性最强的分离株进行了基因组研究。通过形态学、生化分析和16S rRNA基因测序对分离株进行表征。通过基于培养的生长测定评估对CBZ（1–50 mg L?1）的耐受性。CBZ1、CBZ3、CBZ6和CBZ7分别被分类为Enterobacter hormaechei、Paenibacillus lactis、Aeromonas hydrophila和Raoultella ornithinolytica。在评估的四个分离株中，CBZ7在较高CBZ浓度（30–50 mg L?1）下表现出显著更高的相对生长，因此被选择进行全基因组测序。CBZ7草稿基因组包含5,671,759 bp，分布于181个contigs，G+C含量为55.65%，N50为79,780 bp，BUSCO完整度为98.2%，CheckM2估计污染为0.87%。基因组注释揭示了与膜转运和外排、氧化代谢、谷胱甘肽代谢、环境感知和芳香族化合物代谢相关的基因。尽管未鉴定出完整的CBZ特异性分解代谢途径，但结果支持CBZ7对高浓度CBZ的强耐受性，并确定了可能参与外源化合物适应的候选功能。
论文解读
药品残留对水生生态系统的污染日益严重，卡马西平（carbamazepine, CBZ）作为一种持久性药物污染物，在常规污水处理中难以完全去除，并在水体中频繁检出，具有慢性毒性、内分泌干扰及致畸风险。微生物修复被认为是一种有前景的策略，但关于自然暴露于CBZ污染环境中的细菌及其基因组耐受机制的信息仍然有限。因此，研究人员从厄瓜多尔基多Machángara河（该地区污染最严重的水体之一）采集水样，开展CBZ耐受菌的分离、鉴定和基因组研究，旨在鉴定具有强耐受性的菌株，并通过全基因组测序探索其潜在的适应机制。
研究人员采用含2 mg L
?1 CBZ的矿物盐培养基（Mineral Salt Medium, MSM）对河水样品进行富集培养，通过浇板法分离CBZ耐受菌。对分离菌株进行形态学、生化（Microgen GnA + B ? ID系统）及16S rRNA基因测序鉴定。通过1–50 mg L
?1系列浓度的CBZ暴露实验，计算相对生长值（处理组菌落数/无CBZ对照组菌落数×100），并采用单因素方差分析和Tukey HSD检验比较菌株间差异。选择耐受性最强的菌株CBZ7进行Illumina MiSeq全基因组测序，使用SPAdes组装，QUAST评估组装质量，BUSCO和CheckM2分别评估完整度和污染。功能注释采用BV-BRC RASTtk、EggNOG-mapper、GhostKOALA和KofamKOALA等平台，并使用antiSMASH预测次级代谢产物生物合成基因簇。
研究结果部分如下：
3.1 耐药菌最大耐受浓度：在1–50 mg L
?1 CBZ浓度范围内，四个分离株表现出菌株特异性和浓度依赖性的相对生长谱。CBZ1相对生长总体低于25%；CBZ3在低浓度（1–2 mg L
?1）时相对生长接近100%，但在高浓度下逐渐下降；CBZ6在中高浓度下波动；CBZ7在30–50 mg L
?1时相对生长显著高于其他菌株（p < 0.05），因此被选作全基因组测序对象。该结果表明，细菌对CBZ的耐受并非随浓度增加而简单线性下降。
3.2 土著卡马西平耐受菌的分离与筛选：共分离获得四个菌株CBZ1、CBZ3、CBZ6和CBZ7。形态学观察显示其菌落特征和革兰氏染色结果各异。生化鉴定初步将CBZ1、CBZ3、CBZ6和CBZ7分别归属为Enterobacter cloacae、Elizabethkingia sp.、Aeromonas hydrophila和Klebsiella oxytoca，但表型方法分辨率有限，需分子鉴定进一步确认。
3.3 基于16S rRNA基因测序的分子鉴定和系统发育分析：16S rRNA基因测序将CBZ1鉴定为Enterobacter hormaechei（98.88%），CBZ3为Paenibacillus lactis（99.40%），CBZ6为Aeromonas hydrophila（96.57%），CBZ7为Raoultella ornithinolytica（98.92%）。最大似然系统发育树支持这些分类地位，自展值在87%–100%之间。目前R. ornithinolytica在NCBI分类中被视为Klebsiella ornithinolytica的同义名。
3.4 基因组组装：CBZ7的草稿基因组包含181个contigs，总长5,671,759 bp，G+C含量55.65%，N50为79,780 bp，BUSCO完整度达98.2%，CheckM2估计污染为0.87%。注释共预测到5673个蛋白质编码序列（CDSs）、83个tRNA基因和6个rRNA基因。
3.5 功能注释：GhostKOALA注释了3533个蛋白（66.3%），功能类别集中在信号与细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理和碳水化合物代谢等，其中33个条目归属“外源化合物生物降解与代谢”。EggNOG-mapper进一步确认了次级代谢、外源化合物降解和应激反应相关基因的存在。
3.6 KEGG重建和环境响应功能：KEGG分析显示，CBZ7基因组映射到ABC转运蛋白（210）、双组分系统（133）、芳香族化合物降解（32）、苯甲酸降解（27）、谷胱甘肽代谢（21）等通路。候选功能包括4-羟基苯甲酸转运蛋白（K08195）、p-羟基苯甲酸3-单加氧酶/PobA（K00481）、AaeXAB芳香酸外排系统组分（AaeA K15548、AaeB K03468）、谷胱甘肽S-转移酶（K00799）以及多个转录调控因子等。
3.7 次级代谢产物生物合成基因簇：antiSMASH检测到6个生物合成基因簇（BGCs），包括芳基多烯区域、类似frederiksenibactin的NRPS-金属载体区域、萜烯前体区域、RiPP样区域、含唑RiPP区域和杂合NRPS/type I聚酮合酶区域。
讨论部分指出，CBZ7的强耐受性可能与其基因组所编码的膜转运、外排系统、氧化代谢、谷胱甘肽解毒和芳香族化合物代谢等功能相关，但未发现完整的CBZ特异性分解代谢途径。因此，现有结果支持CBZ7对高浓度CBZ的耐受，而非直接降解。研究人员强调，还需通过时间分辨生长曲线、CBZ及其转化产物的化学定量，以及候选基因的功能验证，来确定CBZ7耐受的确切机制及其在生物修复中的潜在价值。
结论部分翻译如下：在补充CBZ的培养基中对马钱加拉河水进行富集，产生了四个具有不同表型、生化和分子特征的细菌分离株。活菌计数分析显示，随着CBZ浓度增加，相对生长曲线呈菌株和浓度特异性，而非均匀下降。在测试的最高浓度（50 mg L
?1）下检测到可培养细胞，表明分离株在实验条件下耐受CBZ。其中，CBZ7在较高CBZ浓度（30–50 mg L
?1）下表现出显著更高的相对生长，因此被选择进行全基因组测序。菌株CBZ7被鉴定为Raoultella ornithinolytica，其5.67 Mb草稿基因组包含181个contigs。互补基因组分析确定了与膜转运、外排、环境感知、氧化代谢、谷胱甘肽相关解毒、芳香族化合物代谢和次级代谢相关的预测功能。这些发现为化学胁迫适应提供了合理的基因组基础，并确定了可能有助于CBZ7在CBZ暴露下生存的候选功能。然而，未鉴定出完整的或CBZ特异性的分解代谢途径；因此，目前结果支持CBZ耐受性。需要进一步结合时间分辨生长测量、CBZ及其转化产物的分析定量以及候选基因的功能验证的研究，以确定CBZ7耐受性的机制并评估其在生物修复中的潜在相关性。
