基于重组酶聚合酶扩增技术快速检测转基因大豆与水稻中bar基因的环境监测方法研究

《GM Crops & Food》：Rapid recombinase polymerase amplification-based detection of the bar gene for environmental monitoring of genetically modified soybean and rice

　　

摘要专业翻译 转基因作物（genetically modified, GM）意外释放的环境监测需要快速可靠的方法。研究人员开发了一种靶向bar基因的实时重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）检测方法，用于快速检测转基因大豆和转基因水稻，并结合一种简化的氢氧化钠（NaOH）DNA提取方法，适用于田间应用。引物-探针组合4提供了最具特异性和可靠性的检测结果，同时大豆lectin基因和水稻actin基因作为内部阳性对照。Lectin和actin分别在转基因及非转基因样品中均能稳定检出。0.1 N NaOH提取方法无需额外纯化即可产生质量足以直接进行实时RPA检测的DNA。该整合检测方法能够特异性检出转基因样品中的bar基因，非转基因样品中无扩增信号，并在39°C条件下约25分钟内产生检测结果。该方法为转基因大豆和水稻的检测与环境监测提供了一种快速、简便且可部署于现场的检测途径。

论文解读文章

研究背景与问题

随着全球对提高农业生产效率并减少环境影响的技术需求日益增长，转基因（genetically modified, GM）作物已成为应对这些挑战的重要策略。转基因作物通过引入或修饰特定基因，赋予传统品种所不具备的优良性状，如抗病虫害、耐除草剂和增产等。自1996年商业化种植以来，全球转基因作物种植面积从约170万公顷增长至2019年的1.904亿公顷，显示出持续扩张趋势。

韩国是全球主要的转基因作物进口国之一。据2024年统计，韩国进口转基因作物约1092万吨，较上年增长6.2%。尽管韩国目前未批准转基因作物的商业化种植，但进口转基因谷物在运输和装卸过程中偶发撒漏，导致在路边及其他非农业环境中频繁检出转基因植株。自2000年代中期以来，在主要粮食进口港口及运输路线附近已报道出现逃逸性转基因玉米种群，饲料加工设施和畜牧场附近也报告了转基因玉米的意外撒漏与定植。日本和加拿大也分别报道了源自运输撒漏的逃逸性转基因油菜在路边及邻近生态系统中长期存续的案例。转基因作物的意外环境释放可能造成生态损害并对非靶标生物产生不利影响，此外转基因向性兼容野生近缘种的基因流动也可能导致遗传污染。

为应对这些潜在风险，国际社会于2000年通过了《卡塔赫纳生物安全议定书》。韩国据此制定了《转基因生物越境转移法》，并在主要流通和运输路线沿线持续开展环境监测，以检测进口转基因作物因运输和装卸过程中谷物意外撒漏而导致的非预期释放。

监测项目通常采用分层检测策略：初步筛查阶段使用基于蛋白质的侧向流动免疫分析（lateral flow immunoassays, LFIAs）进行快速现场决策，阳性结果随后通过实验室PCR检测进行确认。然而，该策略在田间条件下存在局限：LFIA灵敏度较低，且市售产品主要针对耐除草剂和抗虫性状，适用范围有限；PCR检测虽灵敏特异，但需要专门设备和训练有素的人员，不适合现场即时检测。

为克服这些局限，等温核酸扩增技术受到广泛关注。其中重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）可在约37–42°C恒定温度下进行核酸扩增，无需热循环，降低了设备和能源需求，便于与便携式诊断平台集成，适合现场应用。RPA可在约5–20分钟内完成扩增，同时保持较高的分析灵敏度和特异性。

在韩国已批准的转基因事件及环境监测结果中，进口转基因作物主要含有耐草铵膦和耐草甘膦的性状。其中bar基因赋予草铵膦抗性，已被广泛用作多种转基因作物的选择标记或功能性性状基因。然而，据研究人员所知，此前尚无靶向bar基因的RPA检测方法报道。

研究内容与结论

本研究设计了bar基因特异性引物和探针组合，开发了快速、可现场部署的DNA提取方法，建立了整合式RPA检测系统，并评估了该系统的特异性和检测性能及其在田间转基因作物释放后监测中的潜在适用性。该检测方法有望作为环境监测现场快速筛查工具，用于检测转基因作物的意外释放。

关键技术方法

研究人员使用了以下主要技术方法：针对bar基因设计并筛选RPA引物-探针组合，采用常规PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）进行验证；定性RPA和实时RPA分析采用MIRAmp DNA Basic Kit和MIRAmp DNA Exo Kit（AmpFuture Biotech，中国），反应在39°C下进行25分钟，使用便携式实时PCR系统（Gentier Mini，中国）记录荧光信号；同时开发了基于0.1 N NaOH的简化DNA提取方法用于田间检测。植物材料包括含bar基因的β-胡萝卜素增强型转基因大豆（品种Kwangan）和类胡萝卜素生物强化转基因水稻（Hwangkembyeo，源自Nakdongbyeo品种），均来自韩国国立农业科学研究院生物安全部门，非转基因亲本材料由同一机构提供。

研究结果

bar基因靶向引物和exo探针的初步筛选与重新设计。 根据TwistAmp DNA扩增试剂盒检测设计手册推荐的标准设计了五个候选RPA引物组合（P1–P5）。通过定性RPA筛选，P1和P4分别在转基因大豆和转基因水稻中产生最清晰的预期大小扩增产物。由于P1和P4产生的扩增子包含共享的内部靶区域，研究人员设计了一个兼容两个引物组合的exo探针，但初步实时RPA未产生可检测的荧光扩增。对探针未修饰核苷酸序列在39°C下的二级结构分析预测存在ΔG约为?10.42 kcal/mol的最低自由能发夹结构，该结构可能干扰探针与靶序列的杂交或后续核酸外切酶介导的切割。基于此，研究人员重新设计了四个引物-探针组合，综合考虑引物扩增性能、内部探针结合区域的可用性以及探针的预测二级结构。

常规PCR和定性RPA验证。 四个候选引物组合均能特异性地从转基因大豆和转基因水稻中扩增bar基因，非转基因样品中无扩增信号。定性RPA产生了与常规PCR相似的扩增模式，所有引物组合均特异性扩增转基因样品中的bar基因，非转基因样品中无非特异性扩增。由于各组合的扩增模式和条带强度总体相当，定性终点分析无法明确区分其相对性能。此外，研究人员为大豆lectin和水稻actin内源参考基因各设计了三个候选引物组合，经常规PCR和定性RPA评估后各选出一个组合。Lectin引物仅扩增大豆DNA，actin引物仅扩增水稻DNA，在非靶标作物样品和空白对照（no-template control, NTC）中均无非特异性扩增，表明两者可分别作为大豆和水稻的内部阳性对照。

实时RPA检测方法的开发。 为免去凝胶电泳步骤、实现结果的即时可视化，研究人员开发了基于荧光的实时RPA检测方法。exo探针含有荧光基团（FAM）和淬灭基团（BHQ1），分别位于内部dSpacer位点的两侧。探针切割前FAM荧光被BHQ1抑制；探针与靶扩增子杂交后，核酸外切酶在dSpacer位点的切割使荧光基团与淬灭基团分离，产生可检测的荧光信号。四个bar引物-探针组合在转基因样品中均产生荧光扩增信号，但荧光强度和背景扩增特征存在差异。其中组合4在转基因大豆和水稻中产生强荧光信号，在相应非转基因样品中无可检测信号，且重复实验间扩增特征一致，因此被选定用于后续分析。内源参考基因验证表明，lectin和actin分别在转基因和非转基因大豆和水稻样品中稳定检出，可确证DNA提取的充分性和扩增反应的有效性。

基于简化DNA提取方法的田间适用性评估。 研究人员比较了蒸馏水和不同浓度NaOH（1、0.5、0.1、0.05、0.01 N）制备的粗提DNA的扩增性能。常规PCR中，1、0.5和0.1 N NaOH处理组检测到扩增产物，而蒸馏水、0.05 N和0.01 N处理组无扩增。实时RPA比较显示，0.1 N NaOH提取的DNA产生最一致的荧光信号和整体扩增性能，因此被选为最佳提取条件。这可能是DNA释放效率与粗提物对后续扩增反应兼容性之间的适当平衡。使用0.1 N NaOH提取的DNA进行实时RPA分析，bar基因仅在转基因大豆和水稻样品中检出，非转基因样品中无特异性扩增信号；lectin和actin分别在转基因和非转基因大豆和水稻样品中稳定检出。bar基因与内源参考基因结果可联合解读以区分有效的转基因阳性和非转基因结果：bar靶标和相应内源参考基因均检出表明为转基因阳性样品；内源参考基因阳性而bar信号缺失则表明为有效的非转基因结果，而非DNA制备或扩增失败。

反应时间确定。 荧光信号以30秒间隔记录50个循环，共25分钟。反应时间的选择考虑了bar靶标和相应作物特异性内源参考基因在转基因和非转基因大豆和水稻样品中均能被清晰解读，而非仅依据扩增最快的靶标。大豆样品中，转基因大豆的bar基因和lectin基因在反应早期出现明显扩增信号，而非转基因大豆的lectin信号增加较慢并持续至25分钟反应结束，同时无bar特异性扩增。水稻样品中，转基因和非转基因水稻的actin基因在反应早期达到较高荧光水平，但转基因水稻的bar信号增加较慢并持续至25分钟。缩短反应时间可能降低对扩增相对缓慢样品获得清晰可辨阳性bar信号的能力，增加假阴性解读风险。基于整体扩增特征，25分钟被确定为最终反应时间。

讨论与结论

该整合检测方法将简化NaOH提取与实时RPA相结合，可在约25分钟内实现转基因大豆和水稻中bar基因的快速特异性检测。简化样品制备、恒温扩增、实时荧光检测和内源参考对照的组合可减少常规PCR工作流程所需的设备和处理步骤。全球大部分转基因作物种植面积包含耐除草剂、抗虫或两者叠加的复合性状，主要由bar和EPSPS基因家族的耐除草剂基因以及cry家族抗虫基因赋予。将本研究开发的bar基因检测方法与先前报道的含EPSPS基因转基因大豆RPA检测方法以及抗虫转基因玉米事件MON863的实时RPA检测方法相结合，可为快速检测主要商业化转基因作物提供实用平台。该检测方法作为环境监测中疑似转基因大豆和水稻样品的快速筛查工具具有重要应用价值。

研究结论

本研究开发了一种将简化NaOH提取与实时RPA相结合的整合检测系统，可在约25分钟内特异性检测转基因大豆和水稻中的bar基因，非转基因样品中无扩增信号。0.1 N NaOH提取方法可产生足以直接进行实时RPA检测的DNA，无需额外纯化。大豆lectin和水稻actin内源参考基因可确证DNA提取和扩增反应的有效性。该方法具有快速、简便、可现场部署的特点，适用于转基因大豆和水稻的环境监测与快速筛查。