匈牙利人群谷物基食品消费与尿液真菌毒素生物标志物关联及基于LC–MS/MS的膳食暴露评估（2018与2020）

《Toxins》：Associations Between Cereal-Based Food Consumption and Urinary Mycotoxin Biomarkers in a Hungarian Population

　　

真菌毒素（mycotoxins）是食品和饲料链的常见污染物，并与发育障碍、肝毒性（hepatotoxicity）、肾毒性（nephrotoxicity）及多种癌症相关。本研究旨在估计匈牙利人群的膳食真菌毒素暴露并识别主要谷物基食品贡献因素。研究人员通过LC–MS/MS测定尿液真菌毒素浓度，并使用估计每日摄入量（EDI）值评估人群暴露。基于2018年和2020年采集的尿样，研究人员采用Spearman相关分析评估食品消费与尿液真菌毒素水平之间的关联。两年中所有真菌毒素的平均EDI值均低于耐受每日摄入量（TDI），但2018年赭曲霉毒素A（OTA）除外。两个采样年份之间观察到不同暴露模式。2018年，燕麦和燕麦基产品的消费与尿液伏马菌素B₂（FB₂）水平呈中度正相关（r_s = 0.497，校正p = 0.001962350574942）。2020年，小麦和小麦基产品消费与尿液脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）水平相关（r_s = 0.6868，校正p = 0.009509496），而玉米和玉米基产品消费与尿液玉米赤霉烯酮（ZEN）水平相关（r_s = 0.6137，校正p = 0.04134226737）。这些发现强调研究人群和采样时期之间膳食真菌毒素暴露的差异，并强调人类生物监测在识别主要膳食真菌毒素来源/载体以及支持暴露和风险评估中的重要性。

研究背景与目的：真菌毒素（mycotoxins，由丝状真菌产生的次级代谢产物）是食品和饲料链常见污染物，与发育障碍、肝毒性、肾毒性及多种癌症相关。人类暴露主要经污染食品，尤其是谷物。中欧近期监测显示，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）和伏马菌素（fumonisins，FUM）等检出率较高。风险评估的第一步为暴露评估；联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会（JECFA）等已建立健康指导值，如耐受每日摄入量（tolerable daily intake，TDI）。匈牙利既往基于消费和污染数据的研究显示，伏马菌素B₁（FB₁）和FB₂的概率每日摄入量（probable daily intake，PDI）多低于TDI，但约1%个体超过欧洲食品安全局（EFSA）2018年TDI。食品污染加消费数据无法考虑非膳食暴露途径，并受膳食报告和抽样代表性限制。尿液生物标志物（biomarker）可评估内暴露和多种真菌毒素联合暴露，但人类毒代动力学数据缺乏，排泄率多来自猪，增加不确定性。欧洲多国研究显示暴露存在地区和时间差异。由于谷物及谷物基产品中真菌毒素污染未见实质下降，且全球变暖预计增加镰刀菌和曲霉感染，研究人员建议持续监测不同消费人群。本研究的目的是以更大样本重复既往生物标志物暴露评估，并分析尿液生物标志物与食物消费数据之间的关联。

关键技术方法：2018年从匈牙利Somogy、Baranya、Pest counties招募60名志愿者（41名健康者、19名乳糜泻患者），2020年招募35名（13名健康者、22名乳糜泻患者）。采用3天膳食记录（2个工作日、1个周末日），第4天收集24 h尿样；12名受试者使用spot urine并假定日尿量为1.5 L。尿样经水解和净化后，在ISPA-CNR Italy以液相色谱–串联质谱（LC–MS/MS）检测12种真菌毒素及代谢物；肌酐校正后，采用Spearman相关分析评估食物消费与尿液标志物关联，并以假发现率（false discovery rate，FDR）校正多重检验；EDI按尿浓度、尿量、体重和猪研究排泄率计算，并进行尿量敏感性分析。

研究结果：
2.1 尿液真菌毒素浓度：2018年与2020年共采集95份尿样。2018年健康者41名、乳糜泻患者19名；2020年健康者13名、乳糜泻患者22名。LC–MS/MS筛查12种尿液真菌毒素和/或代谢物；NIV、AFM₁、T-2和HT-2毒素因无可定量结果未纳入。2018年多数尿样可定量检出ZEN、FB₁、FB₂和OTA；2020年ZEN在几乎所有健康者样本中可检出，而仅50%乳糜泻样本可定量。DON在2020年77%健康者尿样中可定量，但乳糜泻患者未检出。DOM-1在2018年未检出，而2020年所有样本均检出。FB₁在2020年检出率低于2018年，FB₂在2020年除1例乳糜泻患者外未检出。DON表现出最高平均浓度。OTA在2018年所有样本中检出，2020年无样本检出。2018年健康者尿OTA显著高于乳糜泻患者（p = 0.0028，Wilcoxon检验）；2020年健康者尿ZEN显著高于乳糜泻患者（p = 0.0012，Wilcoxon检验）。多真菌毒素共存方面，2018年所有样本至少含3种共存真菌毒素；2020年多数样本含3种或以上，每份样本至少检出2种。

2.2 基于尿样的暴露估计：EDI采用个体尿真菌毒素浓度、每日尿量、体重及猪研究中24 h排泄率计算；低于检测限（LOD）以LOD/2替代，低于定量限（LOQ）以LOQ/2替代。总ZEN按ZEN + α-ZOL + β-ZOL计算；FB₁ + FB₂合并；DON相关EDI纳入DOM-1并按摩尔质量校正。2018年健康者和乳糜泻患者平均EDI最高者为FB₁ + FB₂和DON，但仅1–2例超过TDI；总ZEN暴露均低于TDI；OTA暴露在所有个体中均超过TDI，健康组最大暴露约达TDI的60倍。spot urine敏感性分析显示，日尿量由1.5 L改为1.0或2.0 L未改变总ZEN、OTA或DON + DOM-1的TDI超标比例；FB₁ + FB₂在2.0 L/day时超标率不变，1.0 L/day时由2例（4.9%）降至1例（2.4%）。2018年乳糜泻患者FB₁ + FB₂暴露显著高于健康者（p = 0.01083，Wilcoxon检验）。2020年健康组约31%样本DON及其代谢物EDI超过TDI，23%个体FB₁ + FB₂超过TDI；ZEN及其代谢物、OTA在所有样本中均低于TDI。乳糜泻患者中DON有2例超过TDI，FB₁ + FB₂有1例超过TDI；2020年健康者与乳糜泻患者各真菌毒素EDI均无统计学显著差异。

2.3 食物消费数据：基于3天膳食记录，研究人员定义六个与镰刀菌毒素相关的食物组，并在消费者中计算均值、最小值和最大值；所有消费数据均按体重标准化。两年中，健康组小麦基产品消费量最高，乳糜泻患者混合无麸质谷物产品消费量最高。部分乳糜泻患者仍报告少量小麦基产品消费，提示无麸质饮食依从不完全。除燕麦和燕麦基产品外，两年中两组在多数食物消费类别上存在显著差异；健康组玉米基和米基产品消费较低；乳糜泻患者小麦基产品消费量显著较低。

2.4 尿液生物标志物与食物消费数据的关联：采用Spearman秩相关分析肌酐校正尿生物标志物浓度与体重标准化食物消费数据。仅纳入高于LOD的毒素。2018年健康者中，燕麦和燕麦基产品消费与尿FB₂呈显著中度正相关（r_s = 0.4970，FDR校正p = 0.001962350574942），与尿OTA呈显著弱正相关（r_s = 0.3753，FDR校正p = 0.0222899472）；玉米和玉米基产品消费与尿α-ZOL呈负相关（r_s = ?0.4564，FDR校正p = 0.0126878）。乳糜泻患者中，玉米和玉米基产品消费与尿DON呈正趋势（r_s = 0.4464，p = 0.0554，FDR校正p = 0.06745532），但未达统计显著。因DON尿排泄相对迅速，研究人员还用尿液采集前一天的食物消费数据分析，未发现显著相关。2020年健康者中，小麦和小麦基产品消费与尿DON显著正相关（r_s = 0.6868，FDR校正p = 0.009509496）；玉米和玉米基产品消费与尿ZEN显著正相关（r_s = 0.6137，FDR校正p = 0.04134226737）。乳糜泻患者中，玉米和玉米基产品消费与DOM-1呈正相关（r_s = 0.4870，FDR校正p = 0.034383779176）；混合无麸质谷物产品消费与尿DOM-1呈负相关（r_s = ?0.4983，FDR校正p = 0.045978572031）。

讨论总结：在尿液真菌毒素谱方面，DON是中欧地区最普遍的真菌毒素；本研究中2018年健康者44%、乳糜泻患者47%尿样可检出DON，2020年健康者77%可检出，且DON浓度最高，比其他分析物高1–2个数量级。多国研究报道了类似结果。DOM-1为DON的肠道菌群代谢物，人类肠道脱环氧酶活性似乎有限；本研究中2018年未检出DOM-1，2020年所有样本可测。健康者中DOM-1平均约占DON浓度的30%，而乳糜泻患者在DON低于LOD时仍可检出DOM-1，可能与代谢、肠道菌群或膳食暴露差异有关。ZEN为第二普遍真菌毒素；2018年除1例外均检出；2020年健康组类似，但乳糜泻患者仅半数高于LOQ；2020年健康者尿ZEN显著高于乳糜泻患者。伏马菌素为第三普遍组；2018年FB₁和FB₂在两组中均100%检出；2020年FB₁仅在31%健康者和59%乳糜泻患者中检出，FB₂仅1例乳糜泻样本检出。Cirlini et al.曾报道乳糜泻患者尿DON和ZEN高于健康者，而本研究2018年未发现DON或ZEN排泄差异，2020年结果不同。AFB₁在两年所有尿样中均未检出。OTA在2018年所有样本中高于LOQ，2020年所有样本低于LOQ，但约85%健康者和59%乳糜泻患者仍高于LOD；2018年健康者尿OTA显著更高。多真菌毒素共存常见。

在基于生物标志物的暴露评估方面，研究人员将结果与Solfrizzo et al.、Lemming et al.、Gerding et al.、Heyndrickx et al.等研究比较。2018年DON超过TDI的比例为健康者4.9%、乳糜泻患者5.3%；2020年健康者升至30.8%，乳糜泻患者为9.1%。德国研究报告12%样本超过DON TDI，比利时研究估计16–69%人群超过耐受摄入量。本研究ZEN在两年均低于TDI。FB₁ + FB₂在2018年健康者4.9%、乳糜泻患者5.3%超过TDI，且两组差异显著；2020年健康者23.1%、乳糜泻患者4.6%超过TDI，但Wilcoxon检验未显示显著差异（p = 0.946）。OTA在2018年所有尿样均超过TDI，2020年无样本超过TDI。AFB₁未检出。上述结果提示DON暴露存在地区和时间变异，并显示尿液生物标志物用于更准确暴露评估的价值。

在膳食摄入与生物标志物水平关联方面，Lemming et al.报道瑞典青少年谷物消费与DON暴露相关。本研究将谷物分组后，2018年未观察到小麦及小麦产品消费与DON暴露显著相关；2020年健康者中小麦及小麦产品消费与DON暴露呈中度强显著正相关。ZEN常在玉米中检出；2020年健康者中玉米及玉米产品消费与ZEN暴露呈强正相关。伏马菌素常存在于玉米及玉米产品，也可存在于小麦、稻米、大麦和燕麦等；本研究中未发现所检测FB₁和FB₂与玉米或玉米产品消费显著相关，但2018年健康者燕麦及燕麦产品消费与FB₂暴露呈显著正相关。研究人员指出，这些相关性与特定谷物组和真菌毒素暴露之间的生物学合理性一致，但未测定参与者实际消费食物中的真菌毒素浓度，因此不能确认相应食物为暴露来源；观察到的相关性应解释为膳食模式与尿液生物标志物水平之间的关联，而非特定膳食来源的证据。暴露评估的重要局限是用于反推EDI的尿排泄分数存在不确定性；多种真菌毒素缺乏稳健人类排泄数据，故使用猪研究排泄分数作为最佳可用估计。由于尿排泄分数位于EDI方程分母，EDI与该参数呈反比，其不确定性直接转化为估计摄入量不确定性。2018年与2020年参与者不同，膳食习惯可能不同，样本量差异明显，因此OTA和DOM-1发生差异不应仅解释为年际变异；OTA还可能来自未纳入相关分析的食物和饮料；本研究设计无法确定这些因素的相对贡献。

结论翻译：总之，研究人员的结果总体上证实了文献报道，尽管观察到一些差异。值得注意的是，本研究两年的结果常彼此不同，突出真菌毒素发生的时间变异性以及环境和膳食因素（如谷物消费模式）对人暴露的影响。研究结果进一步强调尿液生物标志物对准确暴露评估的价值，并表明特定谷物类型和膳食模式影响真菌毒素暴露。此外，无麸质饮食内部的替代选择可能调节生物标志物水平。