切向流过滤作为荧光示踪剂纯化与生产放大的新方法：以西妥昔单抗-800CW和优特克单抗-800CW为概念验证

《mAbs》：Tangential flow filtration as a novel approach for fluorescent tracer purification and production up-scaling: cetuximab-800CW and ustekinumab-800CW as a proof-of-concept

　　

专业摘要翻译 荧光分子成像利用荧光标记抗体能够识别靶细胞并提供局部药物分布的药理学见解。当前采用PD-10柱进行示踪剂的GMP生产方法在处理低浓度抗体、大量样品或不兼容抗体时面临方法学限制。本研究提出切向流过滤作为一种新型且可扩展的方法用于生产临床级荧光示踪剂，并以西妥昔单抗-800CW和优特克单抗-800CW为例证明了其适用性。研究人员优化了用于纯化西妥昔单抗-800CW和优特克单抗-800CW的TFF系统参数，其标记参数和质量控制与PD-10柱生产的示踪剂相当。西妥昔单抗-800CW的生产成功从PD-10法过渡至TFF法。研究人员比较了采用TFF法（n=7）或PD-10法（n=21）生产后在出厂时及于2–8°C储存长达24个月的质量控制数据。结果显示TFF纯化更高效且稳健，标记效率为93.5±2.3%（TFF法）对比68.3±6.9%（PD-10法），未结合染料含量为0.0±0.1%（TFF法）对比0.5±0.3%（PD-10法）。两种方法的稳定性数据相当。TFF法生产的临床级西妥昔单抗-800CW批次至少稳定24个月，浓度范围为0.99–1.08 mg/mL，靶结合亲和力为65–98%，检测到的游离染料和聚集体均远低于3.0%。此外，在PD-10法因颗粒形成而失败后，研究人员成功采用TFF法生产了优特克单抗-800CW。优特克单抗-800CW在2–8°C下稳定储存可达24个月。综上，这证明了在GMP条件下使用TFF进行临床级荧光示踪剂生产的可行性。

论文解读文章

研究背景与目的

荧光分子成像是一种新兴的光学成像技术，通过使用荧光示踪剂和专用成像系统实现分子靶点的可视化。开发高特异性示踪剂可对疾病特异性靶点进行体内成像，因此在手术切缘评估、病灶检测、靶细胞识别、药物分布可视化及靶向治疗反应评估等方面具有广泛应用潜力。过去几年中，多种基于IRDye的荧光示踪剂被成功开发，包括帕尼单抗-800CW、贝伐珠单抗-800CW等，并建立了示踪剂开发的路线图。然而，随着示踪剂开发和临床转化的推进，传统采用PD-10柱的纯化方法暴露出多重局限性：首先，处理低浓度抗体时耗时费力，因为每根柱子的上样体积有限；其次，该方法无法在GMP条件下显著放大生产规模以满足III期临床试验乃至最终获批药品的需求；最后，某些抗体与PD-10纯化过程不兼容，阻碍了示踪剂开发进程。因此，亟需一种兼容放大生产且符合GMP指南的新型制造工艺。切向流过滤，也称为错流过滤，是一种快速高效的膜基生物分子纯化方法，已在抗体-药物偶联物纯化中得到应用。本研究旨在将TFF作为荧光示踪剂GMP生产和放大的新方法，并以西妥昔单抗-800CW和优特克单抗-800CW为概念验证，证明其可行性与优势。

研究方法概述

研究人员采用KrosFlow? RII TFF系统，配备Pellicon 3 Ultracel膜过滤器（30 kDa截留分子量）。关键方法包括：针对西妥昔单抗-800CW，基于原有PD-10法的标记参数（50 mM磷酸钠标记缓冲液pH 8.5，摩尔染料与蛋白比2:1，孵育1–2小时）优化TFF系统参数，使用两个滤器处理1500 mg抗体，控制跨膜压力和流速以防止剪切应力；针对优特克单抗-800CW，基于西妥昔单抗-800CW的参数调整，使用单个滤器处理780 mg抗体。生产过程包括缓冲液置换、标记、纯化（10–12次透析体积）、重力稀释至目标浓度及无菌过滤灌装。质量控制采用尺寸排阻高效液相色谱分析纯度、标记效率和聚集体，间接酶联免疫吸附测定评估靶结合亲和力，并依据欧洲药典方法检测其他指标。统计分析方法包括独立样本t检验、Welch's t检验和Mann-Whitney U检验，并使用Holm-?ídák法校正多重比较。

研究结果

西妥昔单抗-800CW

研究人员比较了采用PD-10法和TFF法纯化的西妥昔单抗-800CW的质量控制数据。SE-HPLC色谱图显示两种方法的保留时间相似，但TFF法在775 nm处检测到的游离IRDye 800CW峰更小。定量分析证实TFF法的游离染料比例显著更低（平均0.0±0.1% vs 0.5±0.3%），标记效率显著更高（平均93.5±2.3% vs 68.3±6.9%）。尽管最终浓度差异具有统计学意义（1.02±0.01 mg/mL vs 1.00±0.01 mg/mL），但这归因于重力稀释而非纯化方法本身。所有批次的产品均符合质量标准。TFF法的回收率高达99±7.1%，产率显著高于PD-10法（104±4.6% vs 95.4±2.5%），但该差异可能源于TFF法处理了所有抗体而PD-10法精确上样。稳定性研究表明，两种方法生产的西妥昔单抗-800CW在2–8°C储存24个月均保持稳定，TFF法一个批次的延长研究显示至少稳定36个月。

优特克单抗-800CW

初始采用PD-10法和90 mg/mL制剂进行开发时，放大过程中观察到严重的可见和亚可见颗粒形成。显微镜分析确认了颗粒形成，而西妥昔单抗-800CW对照未见颗粒。排除所有材料和稀释尝试后仍无法解决颗粒问题。改用TFF法和5 mg/mL制剂后，未再观察到颗粒形成。SE-HPLC色谱图显示标记成功，游离染料仅0.1%。靶结合亲和力显示优特克单抗-800CW与未修饰优特克单抗具有相似的浓度效应曲线和EC50值。长期稳定性研究表明，优特克单抗-800CW在2–8°C储存24个月内各项指标均符合标准，包括浓度维持在0.90–1.10 mg/mL范围内、游离染料不超过2.1%、靶结合亲和力保持在65%–98%之间。值得注意的是，15–25°C储存条件下聚集体比例从9个月开始增加，而2–8°C条件下聚集体比例始终低于1.0%。

讨论与结论

本回顾性研究首次将TFF作为荧光示踪剂GMP生产和放大的纯化方法。通过成功将西妥昔单抗-800CW的生产从PD-10法过渡至TFF法，以及开发优特克单抗-800CW，证明了该方法的可行性。西妥昔单抗-800CW的PD-10法因低浓度抗体导致生产过程需7天、使用280根柱子，而TFF法提供了更高效的解决方案。TFF法还避免了PD-10柱中防腐剂的使用。虽然质量控制比较是回顾性的且受混杂因素影响，但TFF法更高的标记效率可能部分归因于标记时更高的抗体浓度（约10 mg/mL vs 约3.6 mg/mL），而更低的游离染料则源于更多的过滤步骤（10次透析体积去除超过99%游离染料）。对于优特克单抗-800CW，颗粒形成的根本原因尚不清楚，但TFF法可能通过更渐进的pH变化避免了这一问题。此外，TFF法可处理任意浓度的抗体，不受上样体积限制而受滤膜面积限制，且可通过增加滤器实现放大。TFF系统更封闭可控，更符合GMP实践。然而，对于小规模可行性实验，PD-10法因其成本较低而更具优势。研究结论指出，TFF是一种新颖、简便且可扩展的荧光示踪剂纯化方法，可用于GMP条件下生产临床级示踪剂，这是首次报道TFF用于GMP级荧光示踪剂的生产和放大。