嗅觉受体Olfr544在神经元细胞中的作用：神经突生长与CREB信号通路的新机制解析

《iScience》：Role of olfactory receptor Olfr544 in neuronal cells: Insights into neurite outgrowth and CREB signaling

　　

专业术语翻译摘要 嗅觉受体（Olfactory Receptors，ORs）在鼻腔上皮之外广泛表达，并被认为与脑功能相关，但其作用机制仍不清楚。本研究利用小鼠神经母细胞瘤N2a细胞系，探讨了在阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）模型小鼠淀粉样斑块附近高表达的OR Olfr544的功能。研究发现，其激动剂壬二酸（azelaic acid，AZA）以Olfr544依赖性方式促进神经突生长并激活cAMP-PKA-CREB信号级联反应。对Olfr544敲除（knockout，KO）细胞的转录组分析显示，与神经活性信号传导和细胞骨架组织相关的基因表达发生改变。研究鉴定并验证了包括Igf2bp3在内的关键下游靶基因。这些结果在体外建立了非嗅觉OR与神经元形态学之间的功能性联系，为深入研究OR在神经系统中的功能提供了机制基础。

论文主体内容解读

研究背景与科学问题

嗅觉受体（Olfactory Receptors，ORs）是动物嗅觉系统的关键组成部分。然而，随着研究的深入，研究人员发现ORs不仅在嗅觉上皮中表达，还广泛存在于各种非嗅觉组织中，并发挥重要的生物学功能。近年来，研究人员在人类、小鼠和大鼠大脑的多个区域检测到ORs及其下游信号分子（AC3和Gαolf）的表达，提示脑内表达的ORs可能作为G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）发挥作用。这种非嗅觉表达引发了关于其在神经系统内生理作用的重要问题。

现有证据表明，某些脑内表达的ORs可调节小胶质细胞活化、吞噬作用或影响tau蛋白磷酸化，提示其直接参与脑病理生理过程。特别值得关注的是，ORs与阿尔茨海默病等神经退行性疾病之间的关联。例如，OR Olfr544在9月龄5×FAD转基因小鼠（AD模型）的脑皮层和海马中高表达，其表达定位于Aβ斑块附近，并随年龄和疾病进展而变化。

Olfr544的激活剂是壬二酸（azelaic acid，AZA）。作为少数已去孤儿化的ORs之一，Olfr544在胰腺和肝脏中的功能已被阐明，但其在AD小鼠脑中高表达的功能作用在中枢神经系统中仍属未知。鉴于CREB信号在神经元存活、可塑性和记忆形成中的重要性，且ORs可偶联经典的GPCR通路调节细胞内cAMP和Ca²⁺水平，研究人员假设Olfr544可能通过CREB依赖性机制调节神经元的形态和功能。验证这一假设不仅对理解ORs在脑内的非嗅觉功能至关重要，而且对评估其作为神经退行性疾病治疗靶点的潜力具有重要意义。

研究内容与结论

研究人员利用小鼠神经母细胞瘤N2a细胞系，系统解析了OR Olfr544的神经元功能。首先验证了N2a细胞中完整的Olfr544-Gαolf-AC3信号轴的内源性表达，并证实其激动剂AZA以Olfr544依赖性方式促进神经突生长。在缺乏Olfr544的HEK293T细胞中进行的异源重建进一步验证了Olfr544-CREB转录轴的直接作用。生化实验证明Olfr544激活触发经典的cAMP-PKA-CREB信号级联，而CRISPR-Cas9介导的Olfr544敲除完全消除了AZA诱导的细胞内cAMP升高、蛋白激酶A（Protein Kinase A，PKA）活性和磷酸化CREB（pCREB）水平升高。转录组分析揭示了与神经活性配体信号传导和细胞骨架运动蛋白相关的转录程序改变。研究人员进一步预测并实验验证了三个高置信度的CREB下游靶基因，包括Igf2bp3、Sorbs2和Kctd14，其中IGF2BP3表现出最显著的Olfr544依赖性调节。

主要关键技术方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：利用RT-PCR验证N2a细胞中Olfr544、Gαolf和AC3的内源性表达；采用MTT法测定AZA的细胞毒性范围；利用CRISPR-Cas9技术构建Olfr544敲除N2a细胞系；通过异源重建实验（将Olfr544克隆至pME18S-Lucy-Flag-Rho载体并转染HEK293T细胞）验证受体功能；运用双荧光素酶报告基因检测CREB转录活性；通过ELISA检测细胞内cAMP水平；使用PKA活性检测试剂盒测定PKA活性；利用Western blot检测pCREB、CREB及下游靶蛋白表达；通过RNA测序（RNA-seq）对野生型和敲除细胞进行转录组分析，并使用DESeq2进行差异表达分析；采用Reactome、GO和KEGG数据库进行功能富集分析；通过转录因子靶基因预测软件筛选CREB下游靶基因。样本来源为小鼠神经母细胞瘤N2a细胞系和HEK293T细胞系，其中N2a细胞购自Procell，HEK293T细胞由贵州医科大学唐志博士惠赠。

研究结果

N2a神经元细胞中Olfr544信号组分的表达：通过RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳证实，N2a细胞内源性表达Olfr544、Gαolf和AC3，确认了完整的Olfr544信号轴的存在。

AZA促进N2a细胞神经突生长：MTT实验表明，AZA浓度高达640 μM时不影响N2a细胞活力。500 μM AZA处理24小时可诱导约30%的N2a细胞出现突起生长，而血清剥夺对照组仅约10%，差异具有统计学意义，提示Olfr544信号可能在调节神经突延伸中发挥作用。

异源重建验证Olfr544-CREB直接转录轴：将全长小鼠Olfr544 cDNA克隆至pME18S-Lucy-Flag-Rho载体并转染至缺乏内源性Olfr544的HEK293T细胞，AZA刺激可显著诱导CREB驱动的荧光素酶活性，而空载体转染细胞无响应；腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536可显著抑制AZA诱导的CREB活性，证实了Olfr544足以在孤立系统中启动CREB依赖性转录。

Olfr544偶联经典的cAMP-PKA-CREB信号级联：通过CRISPR-Cas9技术构建了Olfr544敲除N2a细胞系，确认了149 bp纯合缺失导致移码和提前终止密码子。Western blot显示，50 μM AZA处理30 min可显著增加野生型（WT）N2a细胞中pCREB水平，而敲除细胞中AZA无法诱导pCREB增加。ELISA检测显示，AZA刺激可显著增加WT细胞中细胞内cAMP水平，但该效应在敲除细胞中完全消失。PKA活性检测显示，AZA可显著增加WT细胞中PKA活性，但在敲除细胞中无此效应。这些结果共同描绘了Olfr544激活→cAMP升高→PKA激活→CREB磷酸化的线性信号级联。

转录组分析揭示与神经元结构相关的候选通路：RNA-seq共检测到26,893个表达基因，差异表达分析（|log₂FC| ≥ 2.807，padj <0.05）鉴定出1,727个差异表达基因，包括1,397个上调基因和330个下调基因。KEGG富集分析显示，上调基因主要富集于神经活性配体-受体相互作用通路（涉及41个基因，包括GPCRs和离子通道蛋白），下调基因主要富集于运动蛋白通路（涉及11个基因，包括肌球蛋白、肌动蛋白和驱动蛋白）。GO分析显示与细胞通讯、突触信号传导和生物过程调节相关。

4.鉴定Olfr544下游CREB调节的候选基因：通过转录因子靶基因预测分析，在敲除细胞中下调基因中鉴定出三个高置信度候选靶基因：Igf2bp3、Kctd14和Sorbs2。Western blot验证显示，IGF2BP3蛋白水平在AZA处理的WT细胞中显著升高，在敲除细胞中显著降低且AZA不能恢复其表达；SORBS2和KCTD14在敲除细胞中也呈一致的下降趋势。其中IGF2BP3表现出最显著的Olfr544依赖性调节。

讨论与结论

本研究的发现表明，AZA激活Olfr544可启动cAMP-PKA-CREB信号级联，调节细胞骨架和运动蛋白相关靶基因（IGF2BP3、SORBS2和KCTD14）的表达，从而影响神经元形态。研究在体外建立了非嗅觉OR与神经元结构可塑性之间的直接机制联系。然而，Olfr544在AD模型小鼠Aβ斑块附近高表达的相关性仍属推测，未来研究应利用Olfr544敲除或转基因小鼠模型评估其在AD相关神经元形态和病理中的因果作用，识别内源性脑配体并确认体内受体激活，以及确定调节Olfr544信号是否影响突触完整性、神经退行性或认知功能等疾病相关结局。

研究局限性

本研究存在若干局限性：主要结论基于N2a神经母细胞瘤细胞系，不能完全模拟成熟原代神经元或完整神经回路的复杂性；转录组比较基于单个单克隆敲除细胞系，差异表达基因应视为候选通路而非确定的Olfr544特异性靶基因；未进行敲除细胞中Olfr544重新表达的挽救实验；CREB与下游靶基因之间的功能联系仍为相关性证据，需通过染色质免疫沉淀（ChIP）等直接结合实验加以证实；由于缺乏验证的特异性抗体，未能在蛋白水平直接确认Olfr544敲除；此外，仅使用了雄性来源的N2a细胞系，无法评估性别对观察结果的影响。