《Analytica Chimica Acta》：A FEN1-LAMP Assay for Sequence-Specific Duplex Detection of Bacterial Vaginosis and Vulvovaginal Candidiasis–Associated Pathogens
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•开发了一种双靶标、序列特异性的FEN1-LAMP检测法，可同时检测加德纳菌和白色念珠菌。•采用FEN1-LAMP检测法，加德纳菌和白色念珠菌的检测限分别为2.5 × 101和2.5 × 103拷贝/μL。•FEN1-LAMP检测法成功在56份临床阴道拭子样本中实现了对加德纳
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开发了一种双靶标、序列特异性的FEN1-LAMP检测法，可同时检测加德纳菌和白色念珠菌。
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采用FEN1-LAMP检测法，加德纳菌和白色念珠菌的检测限分别为2.5 × 101和2.5 × 103拷贝/μL。
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FEN1-LAMP检测法成功在56份临床阴道拭子样本中实现了对加德纳菌和白色念珠菌的双重检测。
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FEN1-LAMP检测法对加德纳菌检测的灵敏度和特异度分别为77.8%和89.7%。
引言
阴道炎是全球女性初级保健和妇科临床中最为常见的疾病之一[1]。毛滴虫病（TV）、细菌性阴道病（BV）和外阴阴道假丝酵母菌病（VVC）是阴道炎的主要病因[2]，[3]。混合性阴道炎是指至少两种阴道感染并存的情况，其中BV与VVC共存（BV/VVC）是最常报道的形式之一[4]。既往研究表明，BV/VVC在混合性阴道炎病例中的患病率差异较大，范围为4.4%至35.06%[5]，[6]。加德纳菌（GV）是BV的主要相关病原，在临床确诊的BV病例中检出率为95%–100%[7]。此外，BV与TV、VVC及其他性传播感染风险升高相关[8]，[9]。白色念珠菌（CA）是VVC的主要病原，是一种机会性共生菌，在阴道微环境失调条件下可致病，尤其在真菌过度生长和双相转化发生时[10]。BV/VVC的治疗尚未形成标准化方案。尽管BV/VVC通常分别采用抗菌和抗真菌药物进行管理[11]，[12]，[13]，[14]，但经验性或长期抗菌治疗可能增加阴道念珠菌定植，使患者易发生后续VVC，甚至促进白色念珠菌氟康唑耐药株的出现[15]。这些治疗挑战凸显了准确鉴定BV/VVC相关病原加德纳菌和白色念珠菌的必要性，这可能有助于改善临床评估和基于病原体的管理。
目前阴道炎的诊断方法包括显微镜检查和革兰氏染色、微生物培养及核酸检测扩增技术。然而，目前国际上尚无针对混合性阴道炎诊断或治疗的标准规范[4]。在中国，BV和VVC通常基于诺格特评分（Nugent评分）≥7分的革兰氏染色阴道分泌物涂片，同时存在假菌丝或芽生孢子进行诊断[11]。尽管革兰氏染色和诺格特评分方法简便且成本低廉，但其耗时费力、依赖解读者经验，且不适用于快速检测，尤其对于诺格特评分处于中间值的情况[16]。对于VVC，显微镜检查和培养仍是常规方法，但显微镜检查往往灵敏度有限，而基于培养的分型鉴定则耗时较长，可能不利于临床决策的及时性，特别是在基层医疗环境中[17]。尽管基于PCR的检测方法可提供针对病原体特异靶标的灵敏多靶标检测[18]，[19]，但其对专业设备和实验室基础设施的依赖限制了其更广泛的使用。因此，迫切需要开发快速、灵敏且易于获取的方法用于检测BV/VVC相关病原。
环介导等温扩增（LAMP）技术由Notomi等人于2000年首次报道，是一种依赖具有链置换活性的Bst DNA聚合酶进行的等温核酸扩增技术。与常规PCR不同，LAMP不需要热循环仪，可使用简易仪器完成。由于其扩增效率高、反应速度快和操作简便等优点，LAMP在即时检测（point-of-care diagnosis）领域引起了广泛关注，尤其是在资源匮乏地区[20]，[21]。然而，传统LAMP技术常出现非特异性扩增。此外，Bst DNA聚合酶缺乏5′→3′外切核酸酶活性，因此无法像实时PCR中的Taq DNA聚合酶那样以序列特异性的方式切割荧光探针。为解决这些局限性，研究人员将耐热链外端核酸酶1（FEN1）和序列特异性链外端探针整合到LAMP系统中，以提高特异性和灵敏度[22]，[23]，[24]。FEN1是一种具有5′链外端核酸酶活性的结构特异性核酸酶，能够高效识别并切割双链外端DNA结构[25]，[26]，[27]。这一特性可实现序列依赖性的信号产生，有助于区分真正的靶标扩增产物和非特异性产物，从而显著提高检测的精确度。
本研究开发了一种FEN1-LAMP检测法，用于同时检测BV/VVC的主要相关病原加德纳菌和白色念珠菌。采用56份临床样本对该检测法的分析性能和临床性能进行了评估。根据加德纳菌检测通道的Tt值，该检测法对区分诺格特评分定义的BV样本与正常样本的灵敏度为77.8%，特异度为89.7%。这些结果表明FEN1-LAMP检测法有望成为一种简易的分子方法，用于同时检测BV和VVC相关病原。
章节摘要
材料与方法
Bst DNA聚合酶（M0275）、耐热FEN1（M0645S）、ThermoPol反应缓冲液（B9004S）和硫酸镁溶液（B1003S）购自美国NEB公司（马萨诸塞州艾普斯维奇市）。dNTP混合物购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司（南京，中国）。无核酸酶水（AC1709-50 mL）由山东星火生物技术有限公司提供（山东，中国）。SYTO-9荧光染料（S34854）购自赛默飞世尔科技公司（马萨诸塞州沃尔瑟姆市，美国）。核酸
FEN1-LAMP检测BV/VVC相关病原的原理
FEN1-LAMP检测法的原理如图1所示。该策略将LAMP扩增与FEN1介导的信号转导相结合，实现序列特异性和多重荧光检测。在初始阶段，靶标核酸通过内外LAMP引物与Bst DNA聚合酶的协同作用进行扩增，通过链置换合成产生特征性的茎环和哑铃状中间产物（图1A）。这些环状扩增产物
结论
综上所述，本研究开发的双重FEN1-LAMP检测法为同时检测BV/VVC相关病原（包括加德纳菌和白色念珠菌）提供了一种快速的分子方法。通过在保持序列特异性识别的同时克服传统LAMP的多重检测局限性，该检测法能够在等温条件下实现加德纳菌和白色念珠菌的双重检测。56份临床样本的评估结果显示，FEN1-LAMP检测法的灵敏度为77.8%，特异度为
CRediT作者贡献声明
林秋远（Qiuyuan Lin）：写作—审阅与编辑，指导。薛恒（Heng Xue）：方法学，概念构思。郁星良（Xingliang Yu）：写作—原稿撰写，可视化，数据整理。陈默（Mo Chen）：写作—审阅与编辑。黄志信（Zhixin Huang）：写作—原稿撰写，可视化。姬俊莉（Junli Ji）：概念构思。陈清泉（Qingquan Chen）：写作—审阅与编辑，指导
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
利益冲突声明
? 作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
致谢
本研究得到以下项目资助：福建省科技联合创新基金（项目编号：2023Y9368）、福建省卫生科技项目（项目编号：2023GGA061）、福建省财政健康专项补助（闽财〔2023〕第830 64号）、国家自然科学基金（22404021）、福建省自然科学基金（2024J01696）。
薛恒|郁星良|陈默|黄志信|姬俊莉|陈清泉|林秋远
