基于环糊精增强离子迁移率-质谱结合计算分析的四环素异构体区分

《Analytica Chimica Acta》：Differentiation of Tetracycline Isomers by Cyclodextrin-Enhanced Ion Mobility-Mass Spectrometry with Computational Insights

　　

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  通过与环糊精（CD）相互作用，利用离子淌度质谱（IM-MS）实现了土霉素（TC）/多西环素（DC）异构体的分离。
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  R_p-p 随环糊精空腔尺寸的增大而降低。
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  密度泛函理论（DFT）计算表明，随空腔尺寸增大，TC/DC 与 CD 的相互作用增强。
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  TC-CD 复合物的结构比 DC-CD 复合物更为紧凑。
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  该方法应用于实际样品检测，回收率≥80.42%，相对标准偏差≤4.69%。

引言

四环素类抗生素由放线菌自然产生或通过半合成方法制备，具有基本的四环四氢萘骨架，通过抑制细菌蛋白质合成发挥抗菌活性 [1]。土霉素（TC）和多西环素（DC）是该抗生素家族的两个典型代表（图 1），在甲基和羟基的取代位置上存在结构差异。此外，其环骨架上的羟基表现出手性对映异构 [2]。四环素类药物在临床治疗和畜牧业中广泛应用 [3]。然而，它们容易与 Ca²⁺ 形成不溶性螯合物 [4]。一旦在人体内积累，这些螯合物将沉积在骨骼和牙齿中，干扰骨骼和牙齿组织的正常发育，并导致牙齿永久性变色。因此，四环素类药物禁用于孕妇和儿童。根据中国国家标准 GB 31650-2019，牛奶中单一或联合四环素类抗生素的最大残留限量设定为 100 μg kg^-1 [5]。因此，开发有效的检测方法用于检测食品中的 TC/DC 残留对于食品安全监管具有重要意义。

各种分析方法已被建立用于四环素化合物的检测。常用的技术包括高效液相色谱法（HPLC）[6]、[7]、毛细管电泳法（CE）[8]和酶联免疫吸附测定法（ELISA）[9]，以及 HPLC 与质谱联用（HPLC-MS）[10]、[11] 等组合方法。HPLC 和 CE 具有高灵敏度，但单次检测通常需要数分钟到十余分钟。虽然 ELISA 能够实现快速、低成本的检测，但它仅适用于初步筛查，无法实现准确的定性鉴定。

离子淌度质谱（IM-MS）是一种先进的二维分析平台，将离子淌度（IM）分离与质谱（MS）检测相结合 [12]、[13]。在离子通过漂移管进行淌度分离的过程中，离子根据其不同的淌度进行区分，这些淌度由其质荷比（m/z）和碰撞截面积（CCS）决定 [14]。CCS 值反映了离子的大小、形状和构象几何结构。利用这一原理，IM-MS 能够有效地区分具有相同 m/z 但不同结构的离子，包括立体异构体和构象异构体 [15]。除了准确的质量测量外，IM-MS 通过实现 CCS 的定量测定还提供结构信息，从而有助于阐明分子构象。这些独特能力使 IM-MS 在异构化合物的鉴定和结构表征方面尤为具有前景。

尽管 IM-MS 在传统上在分离具有细微结构差异的异构体（如立体异构体、构象异构体和位置异构体）时面临分辨率限制，但高分辨率 IMS 平台的持续发展（如循环离子淌度谱：cIMS 和无损离子操纵结构：SLIM）已显著提高了分离能力，并部分缓解了此限制 [16]、[17]。然而，对于某些即使通过这些先进的 IMS 技术仍难以分辨的异构体，主客体非共价识别策略已成为一种可行的替代方法 [18]、[19]，例如 Far 等人使用 4'-硝基苯并-15-冠-5醚作为选择性主分离试剂，通过 IMS 分辨了硒化合物异构体，实现了对仅具有约 2% CCS 差异的异构体的基线分离 [20]；Nag 等人报道了通过 IM-MS 分离环糊精加合 Ag₂₉ 纳米团簇的顺/反式和 fac/mer 异构体 [21]；Perez-Miguez 等人通过主客体衍生化后利用 IMS-MS 实现了 17 种氨基酸的手性分离 [22]。这些研究共同表明，主客体化学与 IMS 的结合是异构体分辨的强大策略，为我们的工作提供了必要的方法学背景。

该方法的核心原理是选择合适的主分子，使其能够通过非共价相互作用与目标异构体相互作用。自 20 世纪 90 年代初以来，环糊精（CDs）已被广泛用作基于质谱的异构体区分中的手性选择剂，因为它们能够与各种客体分子形成非共价包合物 [23]、[24]。复合后，异构客体之间的空间构象差异可以被放大，从而便于通过 IM-MS 进行鉴别 [25]。先前的研究也表明，CDs 作为优秀的主分子具有有利的结构和结合特性 [26]、[27]。鉴于 CDs 的疏水空腔可以容纳 TC/DC 异构体形成结构不同的非共价复合物，预计该方法将进一步增强 IM-MS 对这些密切相关异构体的分辨能力。

在本工作中，开发了一种结合 IM-MS 与计算机模拟的快速策略，以实现 TC 和 DC 异构体的有效分离和鉴定。系统地探索了 TC/DC 与 α-、β- 和 γ-CD 形成的复合物的质谱行为及淌度分离特性。同时，通过 IM-MS 检测全面研究了金属离子对 CD-TC/DC 复合物结构性质的调控效应。采用密度泛函理论（DFT）计算优化了二元复合物 [TC/DC+α/β/γ-CD+H]⁺ 的稳定构象。此外，采用非共价相互作用可视化分析深入阐明了这些复合物体系内部的分子间稳定力。最终，所建立的分析方法成功应用于包括人发、尿液和鸡肉在内的实际样品检测。进一步对该方法进行分析性能综合评价，以验证其可行性和可靠性。

章节摘要

化学试剂

TC/DC（纯度 99.00%，分子量：444.43）和米诺环素（MC，纯度 98.00%，分子量：457.48）购自阿拉丁（上海）试剂有限公司。三种环糊精，包括 α-CD（98.00%，分子量：972.84）、β-CD（98.00%，分子量：1134.98）和 γ-CD（98%，分子量：1297.12），由上海化学工业有限公司提供。本实验采用的所有无机盐试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。LC-MS 级甲醇购自 Alfa Aesar 公司。

异构体及其 CD 复合物的 IM-MS 分析

在本工作中，首先将 TC 和 DC 的标准溶液稀释至预定浓度，未添加任何添加剂。然后使用 TIMS-MS 在正离子模式下对样品进行分析。两种异构体相应的质谱图和离子淌度谱图见图 S1a。TC 和 DC 均在 m/z 值为 445.19 处产生了质子化分子。它们的离子淌度信号大幅重叠，表明无法区分这两种异构体。

结论

本研究采用 TIMS-MS 结合计算机模拟，通过环糊精调查了 DC 和 TC 异构体的分离与鉴定，并进一步将该方法应用于实际样品中这些异构体的检测。IM-MS 结果表明，TC/DC 可与 α/β/γ-CD 形成稳定的复合物，相应的 R_P-P 分别为 1.175、1.079 和 0.098。添加金属离子后，CD 空腔被修饰形成相应的三元复合物，从而……

CRediT 作者贡献声明

潘瑶：调查、数据整理、概念构思。黄作炜：撰写初稿、软件、数据整理、概念构思。丁传帆：撰写审阅与编辑、经费获取。吴芳玲：撰写审阅与编辑、撰写初稿、验证、监督、方法学、数据整理、概念构思。吴乃胜：软件、调查。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些可能影响本文报告的工作。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些可能影响本文报告的工作。

致谢

本研究得到宁波大学先进研究能力建设计划（编号：GJPY2026024）以及国家自然科学基金国际合作与交流计划（W2512055）的资助。

黄作炜|潘瑶|吴乃胜|吴芳玲|丁传帆