NuPath：一种基于TRUPATH的高灵敏度生物传感器，扩展检测基础与激动剂诱导的GPCR激活

《Biochemical Pharmacology》：NuPath, a higher-sensitivity TRUPATH-derived biosensor, expands detection of basal and agonist-induced GPCR activation

生物发光共振能量转移（BRET）生物传感器可直接定量G蛋白偶联受体（GPCR）下游异源三聚体G蛋白的激活，但受限的动态范围可能限制对微弱、亚基特异性或组成性活跃信号的检测。研究人员设计了NuPath——一种基于TRUPATH的生物传感器，其中Gα内的海肾荧光素酶8（RLuc8）被NanoLuc荧光素酶（nLuc）替换，与Gγ融合的绿色荧光蛋白2（GFP2）被增强型黄色荧光蛋白（eYFP）替换，同时保留了原始传感器的插入架构。NuPath适用于常规96孔板形式，并支持受体表达后的直接、无转移读数，无论受体是瞬时转染还是通过稳定细胞系引入，从而简化了实验流程。研究人员在六个GPCR、Gα_i2、Gα_OA、Gα_sL和Gα₁₁以及一系列Gβγ二聚体上对匹配的NuPath和TRUPATH系统进行了并排比较。NuPath在Gα_i2、Gα_sL和Gα₁₁上产生了约3至14倍更大的最大激动剂响应，而Gα_OA传感器产生的响应幅度大致相当，且变异性更低。拓宽的动态范围揭示了TRUPATH测量中基本无法检测到的受体依赖性Gβγ配对差异。NuPath进一步能够检测肝脏表达的抗微生物肽2（LEAP2）对生长激素促分泌素受体（GHSR）组成性信号的反向激动剂介导的抑制，而TRUPATH无法辨别该效应。AlphaFold 3结构模型提示，与等效TRUPATH复合物相比，NuPath中供体-受体间距减小，Gα的α-螺旋结构域位移减少。总之，这些结果将NuPath定位为TRUPATH的一种稳健、模块化增强工具，用于解析激动剂驱动的、Gβγ特异性的及组成性的GPCR信号传导。

论文解读：NuPath生物传感器扩展GPCR激活检测

G蛋白偶联受体（GPCR）是人体中最大的膜受体家族，约35%的获批药物作用于该类受体。GPCR激活后作为鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）催化Gα亚基上的GDP–GTP交换，促进G蛋白重排与解离。异源三聚体G蛋白分为Gα_s/olf、Gα_i/o、Gα_q/11和Gα_12/13四大家族。许多受体可耦联多种G蛋白，耦合程度受受体、配体、细胞环境和实验方法影响。生物发光共振能量转移（BRET）生物传感器可对GPCR下游G蛋白激活进行直接定量，但动态范围受限，难以检测微弱、亚基特异或组成性信号。TRUPATH平台是优化的BRET2生物传感器套件，其Gα亚基插入海肾荧光素酶8（RLuc8）、Gγ融合绿色荧光蛋白2（GFP2），但供体-受体对的光物理性质仍限制灵敏度。为此，研究人员设计并验证了NuPath传感器。

研究人员利用Flp-In CHO细胞（购自Invitrogen）建立稳定表达受体的多克隆细胞系，或瞬时共转染受体与传感器组分。通过聚合酶链式反应（PCR）克隆方法，将TRUPATH中Gα内的RLuc8替换为NanoLuc荧光素酶（nLuc），Gγ上的GFP2替换为增强型黄色荧光蛋白（eYFP），保留原始插入位点，构建匹配的NuPath和TRUPATH传感器。细胞在96孔板中完成转染、培养和测定，采用免转移的直接读数。TRUPATH使用Prolume Purple底物，NuPath使用furimazine底物。结构分析采用AlphaFold 3建模，预测供体-受体几何特征。受体DNA合成和质粒来源包括cDNA.org、Addgene、Twist Bioscience等。

3.1 合理重新设计TRUPATH报告对：研究人员保留了TRUPATH的Gα插入位点和Gγ融合拓扑，将RLuc8–GFP2替换为nLuc–eYFP。nLuc更小（约19 kDa vs 37 kDa），比活更高，eYFP更亮。推测可增大检测窗口。

3.2 NuPath增强神经药理受体下游的Gα_i2反应：使用稳定表达MOR或DRD2的Flp-In CHO细胞，瞬时转染匹配的Gα_i2传感器（Gβ1γ2、Gβ4γ3、Gβ1γ7），DAMGO或普拉克索刺激。NuPath最大反应为TRUPATH的3.4-7.3倍，且效力更接近已知亲和力。NuPath揭示了MOR对Gβ1γ7的反应约为其他组合的一半，而TRUPATH未分辨。

3.3 NuPath揭示Gα_s信号传导中受体和Gβγ依赖的变异：在亲本Flp-In CHO细胞中瞬时共表达MC4R或β2AR和传感器。NDP-MSH或异丙肾上腺素刺激，NuPath产生浓度依赖反应，而TRUPATH接近基线。NuPath分辨出Gβ4γ7最大、Gβ3γ3最小等差异。β2AR的NuPath反应比TRUPATH大4.5-12.2倍。

3.4 NuPath在Gα₁₁质粒DNA输入比例下的性能保持：使用稳定表达CCK1R或GHSR的细胞，在不同Gα:Gβ:Gγ质粒比例（1:1:1和1:6:6）下比较。NuPath最大反应比TRUPATH大4.6-13倍，证明增强效果不依赖DNA比例。

3.5 NuPath能够灵敏检测组成性GHSR信号：GHSR有组成性活性，LEAP2是反向激动剂。在野生型GHSR细胞中，LEAP2诱导NuPath正ΔBRET反应，而GHSR A204E（无组成性活性突变体）无此反应，且capromorelin仍能产生激动剂反应。TRUPATH无法分辨该效应。

3.6 NuPath揭示受体特异的Gβγ偏好：对六个受体的Emax比较显示，NuPath在MOR、MC4R、β2AR、GHSR、CCK1R中检测到统计显著的Gβγ依赖差异，而TRUPATH没有。Gα_OA响应幅度与TRUPATH相当但变异性更低。

3.7 AlphaFold 3建模预测更有利的供体-受体几何结构：对MOR–Gα_i2β4γ3、β2AR–Gα_sLβ4γ7、GHSR–Gα₁₁β4γ3的模型显示，NuPath中nLuc和eYFP距离更近，且TRUPATH大报告对预测会位移α-螺旋结构域（AHD），NuPath更接近参考状态。

讨论部分指出，BRET传感器可直接监测受体近端G蛋白信号，优于下游效应测定。TRUPATH受限于RLuc8/GFP2的低光子输出和信号衰减。NuPath通过nLuc–eYFP改善动态范围和信噪比，并保留TRUPATH模块化。增强的实验窗口有助于分辨Gβγ选择性信号和反向激动剂作用。局限性：未包括Gα_12/13家族；底物成本因供应商而异。结论部分翻译为：总体而言，NuPath代表了一种灵敏且多用途的TRUPATH平台扩展。通过改进动态范围、信噪比和Gβγ依赖性信号差异的分辨能力，同时保留TRUPATH的模块化架构，它为研究GPCR–G蛋白偶联提供了稳健的生物传感器。这些改进可能特别有助于研究弱耦联受体、部分激动剂和反向激动剂，因为在这些情况下，相对微小的信号变化难以用现有生物传感器分辨。此外，增强的测定灵敏度可能促进需要灵敏检测GPCR介导的G蛋白信号的药理学筛选应用。