蛋白质O-GlcNAcylation调控的新兴化学策略：从活性位点抑制到化学诱导邻近编辑与非常规全局调节

《Current Opinion in Chemical Biology》：Emerging chemical strategies for modulating protein O-GlcNAcylation

O-连接β-N-乙酰葡萄糖胺修饰（O-GlcNAcylation）是一种必需且动态的翻译后修饰（PTM），可调控多种细胞过程。O-GlcNAcylation失调与多种人类疾病相关，但尚无靶向O-GlcNAc的疗法获批临床使用，这凸显了对能够精确功能解析该修饰的工具的需求。在本综述中，研究人员调查了过去两年中超越传统活性位点抑制的新兴化学策略，涵盖用于底物特异性O-GlcNAc编辑的化学诱导邻近（CIP）平台，以及包括变构配体和剪接调节剂在内的非经典全局调节剂。研究人员讨论这些新兴工具的设计原则、其在功能研究中的应用及其当前局限。这些化学方法的持续演进将加速O-GlcNAcome的功能注释，并可能最终为靶向O-GlcNAc失调的治疗策略提供信息。

该综述围绕蛋白质O-连接β-N-乙酰葡萄糖胺修饰（O-GlcNAcylation）的化学调控策略展开。O-GlcNAcylation是一种必需且动态的翻译后修饰（PTM），将O-GlcNAc部分连接到细胞核和细胞质蛋白的Ser/Thr或Tyr残基，调控蛋白稳定性、定位和蛋白–蛋白相互作用（PPIs），影响信号转导、转录调控和细胞周期等过程。其稳态失调与糖尿病、癌症和神经退行性疾病等相关。尽管有数千个O-GlcNAcylation事件，但由一对酶催化：书写器O-GlcNAc转移酶（OGT）和擦除器O-GlcNAcase（OGA）。OGT活性口袋大且亲水、底物谱广，选择性小分子抑制剂开发困难，OGT抑制剂仍处临床前阶段；OGA具有深GlcNAc结合位点和二聚体界面疏水口袋，已有抑制剂进入临床试验，但高剂量ceperognastat加速临床衰退及不良事件、实验研究中的突触毒性等引发对长期全局OGA抑制的担忧。因此需要更精确、底物选择性的调控策略。人类O-GlcNAcome（O-GlcNAc蛋白质组）包含逾5000种蛋白，多数具有多个位点，质谱（MS）鉴定与单个O-GlcNAcylation事件功能注释之间仍存在差距。作者综述了过去两年超越传统活性位点抑制的新兴化学策略，包括用于底物特异性O-GlcNAc编辑的化学诱导邻近（CIP）平台，以及包括变构配体和剪接调节剂在内的非经典全局调节剂，讨论设计原则、应用和局限。其意义在于加速O-GlcNAcome功能注释，并为靶向O-GlcNAc失调的治疗策略提供依据。

关键技术方法（≤250字）：该文为综述，主要基于近两年文献整合与机制归纳。所涉平台关键技术包括：化学诱导邻近（CIP）双功能分子、配体导向释放（LDR）共价配体、应变促进叠氮–炔环加成（SPAAC）自组装、随机非标准肽整合发现（RaPID）mRNA展示、噬菌体展示和蛋白质组肽噬菌体展示（ProP-PD）、冷冻电镜（cryo-EM）与X射线晶体学、药物重定位筛选、细胞GFP-OGT微基因报告和体外酶活测定、质谱（MS）糖蛋白质组学及RNA测序（RNA-seq）。论文未涉及特定人群或样本队列来源。

通过CIP实现O-GlcNAcylation的蛋白特异性调控：诱导邻近平台可将酶招募至特定底物。第一代O-GlcNAcylation靶向嵌合体（OGTAC）由Ng课题组报道，因当时缺乏招募内源OGT的非抑制性配体，采用FKBP12^F36V融合OGT（fOGT）。OGTACs将FKBP12^F36V配体AP1867经不同长度聚乙二醇（PEG）连接子连接至卤代烷，诱导fOGT与Halo融合目标蛋白（POI）邻近，实现BRD4、CK2α和EZH2的蛋白特异性O-GlcNAcylation。OGTAC-4通过将BRD4抑制剂JQ1与AP1867偶联，选择性增强BRD4 O-GlcNAcylation。OGTAC-1介导的CK2α Ser347 O-GlcNAcylation增强其与cereblon相互作用，触发泛素–蛋白酶体降解，并重编程Akt和PFKP下游磷酸化，模式不同于CK2α抑制剂或OGA抑制剂Thiamet-G。OGTAC-2将OGT招募至G3BP1，提供OGT招募抑制应激颗粒（SG）形成且不依赖OGT催化活性的初步证据。寡核苷酸（oligo）嵌合体通过E-box序列识别c-Myc，靶向O-GlcNAcylation重连其基因组占据，抑制致癌长链非编码RNA（lncRNA）MALAT1表达并降低癌细胞活力。但转录因子（TF）OGTACs仍依赖工程化OGT。将OSMI-4与E3连接酶配体连接未能诱导OGT降解或改变O-GlcNAcylation。Ng课题组通过LDR将OSMI-4重工程化为非抑制性共价配体，在截短OSMI-4骨架（核心结构Q6S）中引入N-酰基-N-烷基磺酰胺（NASA）弹头，共价标记OGT多个Lys位点（包括结合口袋内Lys440）并保留催化活性；再经SPAAC与DBCO-PEG3-HaloTag配体形成细胞内自组装OGTAC，招募OGT至HaloTag融合CK2α并特异性提高CK2α O-GlcNAcylation。去O-GlcNAcylation靶向嵌合体（DOGTAC）招募内源OGA实现靶向去糖基化；强竞争性抑制剂可招募OGA但因过度抑制酶活而不能功能性去糖基化，经结构导向优化降低OGA结合亲和力以平衡招募与催化活性后，优化DOGTACs（如B2、C4、E2）选择性降低FKBP12^F36V标签化Nup98-HOXA9（NHA9）、Nup98-KDM5A（NK5A）和CK2α的O-GlcNAcylation。Choudhary课题组提出诱导邻近的基团转移嵌合体（GRIPs），重用酶抑制剂招募内源PTM书写器或擦除器；OGA导向GRIP基于Thiamet-G，通过基团转移手柄将FKBP12^F36V配体共价连接至OGA Cys316，在表达FKBP12^F36V标签化CK2α细胞中，OGA GRIP 3.2剂量依赖性去除CK2α O-GlcNAc，且全局O-GlcNAc蛋白质组分析显示靶标选择性高、脱靶效应低；OGT导向GRIP源自OSMI-4，靶向OGT活性口袋附近Cys911，实现CK2α和Nup62靶向O-GlcNAcylation，并验证STAT5上O-GlcNAcylation与磷酸化串扰。LDR型OGTACs、DOGTACs和GRIPs共同构成重利用酶抑制剂的互补策略，共价平台可维持调控并防止洗脱后反弹，可逆平台支持脉冲式控制和洗脱验证。

通过新兴机制实现O-GlcNAcylation的全局调控：变构调节通过活性口袋之外构象变化调控O-GlcNAc循环酶。OGT方面，小分子CDDO（bardoxolone）经高通量筛选鉴定但效力有限（IC₅₀ = 6.56 μM）；RaPID mRNA展示筛选靶向四肽重复（TPR）结构域的宏环肽，获得K_i = 1.5 nM的OGT变构抑制剂；OGT插入结构域（Int-D）经噬菌体展示和ProP-PD被独立鉴定为调控外位点，共识序列肽结合分别导致变构抑制或底物特异性O-GlcNAcylation；Walker课题组开发源自OGT底物HCF-1的多肽HCF3R，以皮摩尔亲和力（K_d ≤ 85 pM）结合OGT并有效抑制其酶活，但肽类工具细胞通透性差，细胞活性小分子OGT变构调节剂仍待开发。OGA方面，van Aalten课题组通过cryo-EM和X射线晶体学解析全长结构，发现C端假组蛋白乙酰转移酶（pHAT）结构域虽无催化活性，但可通过构象变化调节活性位点微环境；删除pHAT域破坏细胞O-GlcNAc反馈稳态，提示OGA活性增强或底物滥交性增加，为小分子OGA变构调节剂提供结构蓝图。剪接策略方面，Woo课题组通过三项并行药物重定位筛选，包括细胞GFP-OGT微基因报告和两项体外酶活测定，鉴定GSK690693和Y-33075为剪接调节剂，在转录水平同时下调OGT和OGA，净效应为提高全局O-GlcNAcylation；该作用独立于其原注释靶点（GSK690693为AKT，Y-33075为ROCK），结构匹配阴性对照不影响OGT或OGA表达，证实剪接调节活性可与激酶抑制分离。但RNA-seq显示二者产生广泛转录组效应，需开发选择性更高的剪接调节剂。

结论与展望/讨论总结：用于O-GlcNAc调控的化学工具已从传统活性位点抑制剂演变为多样化工具箱，包括全局调节剂和底物特异性编辑器。OGT独特的成药性挑战及与慢性OGA抑制相关的毒性担忧，促使研究人员探索活性位点之外的替代策略。全局调节剂——从传统活性位点抑制剂到共价、变构和剪接调节剂——能够快速进行系统范围扰动，以产生与O-GlcNAc稳态相关的目标表型。相反，近期靶向编辑策略可精确操纵单个底物上的O-GlcNAcylation，将特定修饰事件与下游功能联系起来。这些互补方法已开始弥合O-GlcNAcylated蛋白的相关性鉴定与其生物学功能机制理解之间的差距。讨论指出，O-GlcNAc生物学仍多处于机制探索阶段；定点突变可能破坏磷酸化等竞争修饰或触发替代位点补偿性O-GlcNAcylation，虽可实现位点特异性去除O-GlcNAc，但精确可控地在特定蛋白或位点安装仍是技术障碍。OGTACs和GRIPs揭示CK2α O-GlcNAcylation驱动降解、OGT在SG动态中的非催化功能、c-Myc转录活性重编程及与泛素化、磷酸化串扰。化学控制系统的快速可逆调控可将修饰动态与表型响应时间关联，但仍需催化失活突变体、竞争实验和独立读出等正交验证。同时，向内源未标签POI同时招募内源OGT/OGA仍是挑战；遗传编码和光遗传系统面临递送、安全及光穿透限制；化学平台通透性和药代动力学尚不清晰，复杂组织中靶标选择性未建立；O-GlcNAcylation丰度低且动态，增加功能读出难度。未来可发展多价策略或靶向OGT/OGA相互作用伙伴的双功能分子，实现通路水平或底物簇的协调编辑，并结合定量糖蛋白质组学和网络分析。原文作者为Jiajun Wu和Bily Wai-Lung Ng。