《Environment International》：Benzo[a]pyrene and bisphenol A interact to induce combined pulmonary toxicity through an integrated transcriptomic-metabolomic network
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苯并[a]芘（benzo[a]pyrene，BaP）与双酚A（bisphenol A，BPA）联合暴露在体内（in vivo）和体外（in vitro）均诱导了联合肺毒性。联合暴露在小鼠中触发了免疫抑制和脂质代谢失调。联合暴露影响了A549细胞的细胞周期进程、
苯并[a]芘（benzo[a]pyrene，BaP）与双酚A（bisphenol A，BPA）联合暴露在体内（in vivo）和体外（in vitro）均诱导了联合肺毒性。联合暴露在小鼠中触发了免疫抑制和脂质代谢失调。联合暴露影响了A549细胞的细胞周期进程、细胞凋亡和侵袭表型。EGFR/FOXM1信号通路可能介导了BaP与BPA增强的细胞侵袭。甘油磷酸胆碱（glycerophosphocholine，GPC）介导了联合暴露引起的整体免疫抑制效应。
苯并[a]芘（benzo[a]pyrene，BaP）是典型的多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbon，PAH），主要来源于有机质不完全燃烧、机动车尾气和工业排放，被世界卫生组织列为优先致癌污染物；双酚A（bisphenol A，BPA）是聚碳酸酯和环氧树脂的工业原料，其大气污染常被忽视。在真实大气环境中，两者常以复杂混合物的形式共存。联合暴露的健康风险可能比单一暴露更复杂，但二者在肺泡上皮细胞中的相互作用模式和分子机制尚未阐明，尤其缺乏在免疫和代谢通路中交互作用的实验证据。为此，研究人员建立了涵盖多通路交互和多终点联合效应的毒理学评估框架。
该研究以C57BL/6J小鼠（购自扬州大学比较医学中心）和A549细胞（购自上海复恒生物）为模型，通过气管滴注和体外染毒，结合组织病理、生化指标、流式细胞术、RNA测序、非靶向代谢组学、分子动力学模拟及交互模式网络分析，系统比较了BaP、BPA单独及联合暴露48 h后的肺部毒性。结果表明，联合暴露诱导了明显的小鼠肺损伤，并伴随局部炎症和系统性免疫抑制；在A549细胞中引起细胞周期S期阻滞、凋亡增加和侵袭增强；机制上涉及EGFR/AKT信号通路、FOXM1竞争性结合以及甘油磷脂代谢物GPC介导的免疫抑制。研究成果发表于《Environment International》，为复合污染物的健康风险评估和相互作用靶点筛选提供了理论依据。
技术方法上，该研究运用了小鼠肺组织H&E染色、肺组织和肺泡灌洗液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）及一氧化氮（nitric oxide，NO）检测；流式细胞术分析免疫细胞亚群、细胞周期和凋亡；RNA测序和非靶向代谢组学联合分析，结合KEGG通路富集和基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），并用RT-qPCR、Western blot和免疫荧光进行验证；通过siRNA敲低、小分子抑制剂处理验证EGFR信号通路；利用AutoDock Vina和GROMACS对BaP、BPA与FOXM1 DNA结合域（DNA-binding domain，DBD）进行单/多配体分子对接和100 ns分子动力学模拟；最后用因子设计方差分析和交互模式网络将多组学数据与表型关联。
3.1 联合暴露BaP和BPA引起小鼠肺损伤：H&E染色显示，联合暴露组支气管壁增厚、免疫细胞浸润和肺泡结构紊乱最显著；肺组织和支气管肺泡灌洗液（BALF）中LDH活性及BALF中NO水平均显著升高；外周血白细胞计数显著下降，淋巴细胞比例降低而单核细胞比例升高。这提示联合暴露导致肺组织损伤并伴随系统性免疫抑制。
3.2 联合暴露影响A549细胞存活和侵袭：细胞活力实验显示，10 μM BaP与10 μM BPA联合暴露显著抑制细胞活力，且存在交互作用（p=0.003）；流式细胞术显示S期细胞比例显著增加，凋亡率升高至对照组的1.94倍；Transwell实验显示侵袭细胞数增加1.91倍。说明联合暴露通过干扰细胞存活和促进侵袭影响肺泡上皮细胞。
3.3 联合暴露引起转录失调和代谢重塑：RNA测序鉴定出909个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），GSEA显示联合暴露组主要负调控免疫相关通路，同时影响内源性代谢通路；非靶向代谢组学鉴定出159个差异代谢物（differentially expressed metabolites，DEMs），以脂质代谢相关分子改变为主。转录组和代谢组共同指向甘油磷脂代谢等核心通路。
3.4 联合暴露通过激活EGFR信号促进细胞侵袭：基于CTD数据库筛选和Western blot验证，联合暴露显著增加p-EGFR/EGFR比值；siRNA敲低EGFR或Erlotinib抑制后，EMT相关基因（SNAI2、VIM等）的异常表达被逆转，侵袭增强效应减弱；进一步比较AKT抑制剂和ERK抑制剂的效应，发现PI3K/AKT是主要下游通路。因此BaP和BPA通过EGFR/AKT调控EMT相关转录，增强细胞侵袭。
3.5 多配体分子动力学揭示FOXM1的潜在中介作用：GPSAdb预测FOXM1是联合暴露下游关键转录因子；分子动力学模拟显示，BaP单独存在时与FOXM1-DBD结合较持久，而BaP与BPA同时存在时呈现竞争性结合，导致残基接触和配体停留时间发生改变。这提示FOXM1可能是污染物理性竞争靶点，参与细胞周期和存活调控。
3.6 交互模式网络揭示甘油磷脂代谢紊乱与免疫抑制的联系：转录组-代谢组联合分析表明甘油磷脂代谢是联合暴露的核心代谢异常节点；通过因子设计方差分析将表型和分子改变归入BPA主导、BaP主导、交互正性和交互负性四种模式，发现联合暴露的毒性由多个基因/代谢物集合的一致性变化共同决定，其中外周血白细胞减少与多个甘油磷脂代谢物显著关联。
3.7 联合暴露通过干扰GPC诱导免疫细胞免疫抑制：免疫浸润分析显示肺CD8
+ T细胞丰度显著下降，免疫荧光验证了CD8和CD19表达降低；在联合暴露前口服补充甘油磷酸胆碱（glycerophosphocholine，GPC），小鼠外周血白细胞计数由1.27 mU/mL回升至2.92 mU/mL，免疫细胞比例部分恢复，但肺内CD8
+ T细胞仅轻微增加。结果表明GPC介导联合暴露的外周免疫抑制效应，而在肺局部作用有限。
讨论部分指出，联合暴露的肺损伤特征是免疫抑制与脂质代谢紊乱的叠加；EGFR的共同激活可能以剂量相加方式发生，主要转向PI3K/AKT通路而非MAPK/ERK；BaP与BPA在FOXM1上的竞争性结合可能干扰FOXM1构象和功能。交互模式网络为从分子集合到毒性表型的因果推断提供了新思路。同时，GPC升高可能反映了代偿性代谢响应，参与外周免疫调节。该研究存在局限性，如急性暴露剂量较高、仅使用单一剂量组合、动物模型与细胞模型差异等。
总之，该研究表明，BaP与BPA联合暴露诱导了与单一暴露不同的肺损伤，其联合效应与上皮细胞毒性、代谢紊乱和免疫抑制重塑相关。机制上，联合暴露通过EGFR/AKT依赖性调控EMT相关转录来促进A549细胞的侵袭表型；对细胞周期的影响可能与污染物竞争性结合FOXM1有关；在组织水平，联合暴露扰乱甘油磷脂代谢，尤其使L-α-甘油磷酸胆碱（L-GPC）异常升高，进而影响免疫细胞群体丰度。该研究的交互作用模式框架为筛选关键分子、阐明联合毒性机制以及进一步完善面向混合物的健康风险评估提供了有用基础。
