三氯生暴露通过肠道菌群调节果蝇幼虫免疫功能的机制研究——无菌条件加剧免疫毒性效应

《Environmental Advances》：Axenic condition modulates triclosan-induced immune dysfunction in Drosophila melanogaster larvae

　　

三氯生（Triclosan, TCS）暴露会降低血细胞数量及其功能；TCS暴露促进生物体菌群失调；TCS暴露产生ROS并降低血细胞中的ATP水平；TCS改变血细胞中抗菌肽（AMP）、炎症因子和脂肪酸氧化（FAO）基因的表达；TCS的免疫毒性可通过维持肠道细菌来调控。 黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）在过去二十年中已成为毒理学研究中成熟的模式生物，因其遗传学和发育生物学特征清晰、生命周期短、繁殖率高且符合3R原则。欧洲替代方法验证中心（ECVAM）也已批准果蝇用于毒理学研究。本研究在常规和无菌（axenic，即体内不含微生物）条件下，对三氯生（TCS）在果蝇幼虫中的免疫毒性进行了比较评估。果蝇的免疫细胞统称为血细胞（hemocytes），主要包括三种类型：1. 浆细胞（Plasmacytes），占血细胞总数的90-95%，执行吞噬功能；2. 晶体细胞（Crystal cells），占血细胞总数的5-10%，负责凝血功能；3. 片层细胞（Lamellocytes），健康个体中极少存在，主要在寄生蜂感染时分化为完成包裹作用。此外，果蝇免疫系统通过调节细胞因子样分子和抗菌肽（AMP）来启动适当的免疫应答。这些免疫组分在进化上是保守的，其数量、功能和表达的任何失衡都被视为免疫毒性的敏感指标。进一步地，果蝇携带两种主要的可培养细菌物种——乳杆菌（Lactobacillus）和醋杆菌（Acetobacter），它们具有生物学相关性且易于培养。在果蝇中建立和维持无菌条件简单且可重复，使其成为比较毒理学评估的理想体系。 TCS是一种合成的氯化芳香族化合物，具有广谱抗菌特性，被视为一种新兴污染物。全球TCS年产量已达1500吨，且在COVID-19疫情后因消毒需求增加而持续增长。TCS在化妆品和个人护理产品中的最大允许限量为0.3%。在环境基质和生物样本中，TCS在不同范围内被检出，例如污水处理厂进水为17.8 μg/L-67.1 μg/L，河流中为74.3 μg/L，自来水中高达9.74 ng/L，室内灰尘中为5-1090 ng/g，人母乳中为0至2100 μg/kg脂质，尿液中为100 ng/mL，肝脏中为3.14 ng/g。广泛的研究报告表明，TCS具有内分泌干扰效应，其影响因生物类型、暴露时间和环境变量而异。机制上，TCS诱导氧化应激，促进DNA损伤和细胞凋亡，扰乱细胞周期，干扰代谢和表观遗传编程，并破坏多种细胞信号传导，导致组织学异常、神经毒性、内分泌干扰、生殖毒性，甚至有研究报告TCS暴露可导致鱼类心脏水肿。 生物的免疫系统对内外部应激源敏感，维持免疫平衡对免疫和非免疫功能均至关重要。多项研究已通过各种机制在不同模式生物中证明了TCS的免疫毒性潜力。例如，通过引发氧化应激并降低抗氧化能力，导致斑马鱼免疫失衡；在肥大细胞中，TCS升高ROS水平，导致线粒体分裂；研究人员最近的研究也表明，TCS暴露会导致黑腹果蝇中ROS依赖的多代免疫毒性；另有研究提示TCS在斑马贻贝血细胞中的遗传毒性可能与氧化应激有关；TCS在泥蚶中的免疫毒性可能归因于免疫代谢和解毒过程的紊乱；还有研究表明TCS暴露可促进人巨噬细胞从线粒体氧化磷酸化向糖酵解的代谢转换，从而诱导促炎表型；此外，TCS可触发人免疫细胞中促炎细胞因子的分泌。 肠道微生物群已被证明是维持生物体免疫稳态的关键调节因子之一，在免疫细胞的发育、免疫调节代谢物的产生、抗菌肽的分泌以及模式识别受体的刺激中发挥重要作用。关于TCS暴露，斑马鱼研究显示TCS扰乱了肠道菌群组成，可能影响肠脑轴；在小鼠结肠炎模型中，TCS暴露导致保护性细菌（产丁酸菌）减少和有害细菌（硫酸盐还原菌和拟杆菌属）增加，可能加剧结肠炎；另一项小鼠研究中，TCS暴露改变了肠道微生物群并导致脂多糖积累，这可能与肝损伤有关。所有这些研究都表明，TCS暴露会影响肠道菌群组成，这可能与系统性毒性相关。然而，关于TCS诱导的免疫毒性与肠道细菌变化之间关联的研究仍然有限。因此，研究人员假设微生物群的存在可能影响TCS诱导免疫应答的程度。通过比较常规和无菌果蝇幼虫在TCS暴露后的免疫参数，如血细胞总数、功能以及免疫相关基因的表达，可以推断肠道细菌对TCS相关免疫挑战的可能贡献。

研究背景

三氯生（Triclosan, TCS）是一种广谱抗菌化合物，广泛应用于化妆品、医疗保健和家居产品中，全球年产量达1500吨，新冠疫情后因消毒需求激增而进一步增加。TCS作为一种新兴污染物，已在污水、河水、自来水、室内灰尘、母乳、尿液和肝脏等多种环境和生物样本中被检出。大量研究表明，TCS具有内分泌干扰、神经毒性、生殖毒性等多种毒性效应，其机制涉及诱导氧化应激（Oxidative Stress）、DNA损伤、细胞凋亡以及扰乱细胞信号通路。免疫系统对内外应激源高度敏感，多项研究已在不同模式生物中证实了TCS的免疫毒性潜力，例如在斑马鱼、肥大细胞和人巨噬细胞中均可观察到免疫失衡或炎症反应。然而，目前关于TCS诱导的免疫毒性与肠道菌群变化之间的关联研究仍十分有限。肠道微生物群在维持免疫稳态中发挥关键作用，包括免疫细胞发育、免疫调节代谢物产生和抗菌肽（Antimicrobial Peptide, AMP）分泌等。因此，探究肠道菌群在TCS免疫毒性中的作用具有重要意义。

研究目的与结论

为阐明肠道菌群对TCS免疫毒性的影响，研究人员利用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫作为模式生物，在常规（非无菌）和无菌（axenic，即完全不含微生物）条件下进行TCS暴露比较研究。通过检测血细胞（hemocytes）数量与功能、ATP水平、活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）含量以及免疫相关基因表达等指标，系统评估TCS的免疫毒性。研究得出以下主要结论：TCS暴露显著降低果蝇幼虫的可培养肠道细菌负荷，减少浆细胞（plasmacytes）和晶体细胞（crystal cells）数量，抑制吞噬功能，延长凝血时间，降低血细胞ATP水平并升高ROS水平；同时，TCS上调脂肪酸氧化（Fatty Acid Oxidation, FAO）相关基因（hnf4、whd、mtp beta）以及抗菌肽（defensin、attacin、metchnikowin、PGRP-LC）和炎症细胞因子（upd1、upd2、upd3）的基因表达。更重要的是，在无菌条件下，上述免疫毒性效应进一步加剧，表明肠道菌群的缺失使机体对TCS的免疫毒性更加敏感。这一发现揭示了肠道微生物在维持免疫稳态中的保护性作用，并为理解TCS通过肠道菌群介导的免疫毒性机制提供了新见解。

关键技术与方法

1. 1.
   果蝇品系与TCS暴露处理：使用野生型 Oregon R+ 株、遗传匹配对照 W¹¹¹⁸ 株以及转基因品系 Hml>GFP（用于标记血细胞）。将一龄幼虫暴露于三个亚致死浓度（1.0、10.0、100.0 μg/mL）的TCS中96小时，直至晚期三龄幼虫。
2. 2.
   无菌果蝇培养体系的建立与验证：参照Kietz等方法，经去卵壳、抗生素（四环素）处理并在无菌环境中连续饲养三代获得无菌果蝇。通过培养法（LB琼脂平板）和16S rRNA基因PCR双重验证无菌状态。
3. 3.
   血细胞计数与功能检测：利用荧光显微镜和ImageJ软件对 Hml>GFP 幼虫的血淋巴进行浆细胞计数；通过热处理激活黑色素化级联反应后统计晶体细胞数量；采用印度墨汁吞噬实验评估吞噬活性；通过针刺伤口后记录黑色斑点形成时间测定凝血能力。
4. 4.
   基因表达分析：提取血淋巴RNA，逆转录为cDNA后，使用TB Green染料法和CFX96实时荧光定量PCR系统检测目标基因mRNA水平，以 β-actin 为内参基因。
5. 5.
   细胞能量与氧化应激检测：使用ATP检测试剂盒通过化学发光法测量血细胞ATP含量；采用二氢乙啶（Dihydroethidium, DHE）荧光探针染色后通过荧光显微镜和ImageJ量化ROS水平。

研究结果

3.1 TCS暴露对果蝇幼虫可培养肠道细菌负荷的影响

通过平板涂布计数发现，与对照组（约2.159×10⁵ CFU/mL）相比，TCS暴露96小时后，可培养肠道细菌数量呈剂量依赖性显著下降，TCS1、TCS10和TCS100组分别降至约1.178×10⁵、1.133×10³和0.6×10¹ CFU/mL，表明TCS破坏了肠道微生态平衡。

3.2 肠道细菌对TCS暴露后循环免疫细胞数量的影响

与非无菌对照组相比，无菌对照组浆细胞数量显著减少约49.0%。在非无菌条件下，TCS10和TCS100组的浆细胞数量较对照组分别下降约10%和20%；而在无菌条件下，相同浓度的TCS导致浆细胞数量下降约27%和47%，降幅更大。对于晶体细胞，无菌对照组较非无菌对照组减少约12%；非无菌条件下TCS10和TCS100组晶体细胞分别下降约7%和16%；无菌条件下则分别下降约6%和14%。最低浓度TCS1在两种条件下均未引起显著变化。结果表明，无菌条件加剧了TCS对血细胞数量的抑制作用。

3.3 肠道微生物对TCS暴露后果蝇幼虫循环免疫细胞功能的影响

吞噬活性方面，无菌对照组较非无菌对照组下降约20%。非无菌条件下，TCS10和TCS100组吞噬活性分别下降约12%和19%；无菌条件下则分别下降约17%和25%，降幅更为明显。凝血时间方面，无菌对照组的凝血时间比非无菌对照组延长约4.2分钟。非无菌条件下，TCS10和TCS100组凝血时间分别延长约3.0和5.0分钟；无菌条件下则分别延长约3.3和4.4分钟。两种条件下的凝血时间差异不显著，提示晶体细胞功能相对独立于细菌状态。

3.4 肠道细菌对TCS暴露后果蝇幼虫吞噬基因表达的影响

与非无菌对照组相比，无菌对照组血细胞中 nimrod 和 eater 基因表达分别下调约3.5倍和2.0倍。非无菌条件下，TCS10和TCS100组 nimrod 表达下降约1.4倍和1.5倍，eater 表达均下降约2.0倍；无菌条件下，nimrod 表达下降约2.0倍和3.0倍，eater 表达下降约4.0倍和5.0倍，无菌条件加剧了基因表达的抑制。

3.5 TCS暴露后果蝇幼虫循环免疫细胞ATP水平的改变

无菌对照组与非无菌对照组的ATP水平无显著差异。非无菌条件下，TCS10和TCS100组ATP水平较对照组分别下降约2.0倍和2.5倍；无菌条件下分别下降约1.3倍和1.8倍。值得注意的是，在相同TCS浓度下，无菌条件的ATP水平反而高于非无菌条件，可能与代谢适应有关。

3.6 TCS暴露与循环血细胞中ROS水平升高相关

无菌对照组血细胞ROS水平较非无菌对照组升高约5.3倍。非无菌条件下，TCS10和TCS100组ROS水平分别升高约6.0倍和9.0倍；无菌条件下分别升高约7.0倍和12.0倍。无菌条件进一步放大了TCS诱导的氧化应激。

3.7 无菌条件影响TCS暴露后血细胞中FAO基因表达

无菌对照组中 hnf4、whd 和 mtp beta 基因表达较非无菌对照组分别上调约1.6、1.7和1.7倍。非无菌条件下，TCS10组上述基因分别上调约2.1、2.2和1.7倍，TCS100组分别上调约3.0、3.6和3.1倍；无菌条件下，TCS10组分别上调约2.4、2.9和2.4倍，TCS100组分别上调约6.4、5.2和4.5倍，无菌条件促进了FAO基因的更高表达。

3.8 无菌条件改变TCS暴露后果蝇幼虫抗菌肽和炎症细胞因子基因表达

抗菌肽方面，无菌对照组与非无菌对照组无显著差异。非无菌条件下，TCS10和TCS100组 defensin、attacin、metchnikowin 和 PGRP-LC 均显著上调；无菌条件下上调幅度更大，例如TCS100组分别上调约4.5、4.7、5.6和4.0倍。炎症细胞因子方面，无菌对照组 upd1、upd2 和 upd3 较非无菌对照组分别上调约1.6、1.6和1.0倍。非无菌条件下，TCS10和TCS100组 upd1、upd2、upd3 显著上调；无菌条件下上调幅度进一步增大，TCS100组分别上调约11.6、7.7和7.2倍。

讨论总结

研究讨论部分指出，TCS暴露导致果蝇幼虫可培养肠道细菌数量减少，这与以往在小鼠、斑马鱼和大鼠中的研究结果一致。血细胞数量和功能的下降，包括浆细胞和晶体细胞减少、吞噬和伤口愈合能力减弱，与之前在其他生物中的发现相符。ATP水平降低和ROS水平升高表明线粒体功能障碍和氧化应激参与了TCS的免疫毒性机制。FAO相关基因的上调可能反映了免疫激活时代谢方式的转变。抗菌肽和炎症细胞因子基因的过度表达提示免疫系统的过度激活，可能导致组织损伤。重要的是，无菌条件下所有免疫毒性效应均加剧，这凸显了肠道菌群在维持免疫稳态中的保护性作用。肠道菌群通过产生短链脂肪酸（Short-Chain Fatty Acids, SCFAs）等代谢产物调节免疫细胞分化和功能，而无菌条件剥夺了这一保护机制，使机体对TCS的毒性更加敏感。

研究结论

研究人员的发现表明，发育期暴露于TCS会深刻破坏黑腹果蝇幼虫的免疫稳态，具体表现为血细胞计数、吞噬作用、伤口愈合、ATP产生、抗菌肽基因表达和炎症基因表达的改变，同时幼虫肠道中可培养细菌数量减少。值得注意的是，TCS上调了循环细胞中FAO相关基因（whd、hnf4、mtp beta）和ROS水平，这与免疫受损状态相关。此外，无菌条件加剧了这些缺陷，强调了肠道微生物群在维持免疫能力中的重要保护作用。本研究突显了TCS通过摄入途径介导的广泛免疫毒性，以及肠道细菌在维持TCS暴露下免疫稳态中的可能作用。然而，还需要进行肠道微生物群表征和单菌定植研究，以确定细菌驱动的TCS诱导免疫毒性的机制。