《Food Bioscience》：Co-expression of hemoglobin to enhance the expression level of a novel ι-carrageenase OUC-CgiA-Lf with distinct catalytic properties
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摘要：ι-角叉菜聚糖酶是有前景的生物催化剂，可用于制备结构明确定义的ι-角叉菜聚糖低聚糖。在本研究中，一种新型GH82 ι-角叉菜聚糖酶OUC-CgiA-Lf被异源表达于毕赤酵母中并进行生化表征。在三个独立的纯化批次中，纯化后的酶在标准测定条件下对ι-角叉菜聚糖的平均比活性为
摘要：
ι-角叉菜聚糖酶是有前景的生物催化剂，可用于制备结构明确定义的ι-角叉菜聚糖低聚糖。在本研究中，一种新型GH82 ι-角叉菜聚糖酶OUC-CgiA-Lf被异源表达于毕赤酵母中并进行生化表征。在三个独立的纯化批次中，纯化后的酶在标准测定条件下对ι-角叉菜聚糖的平均比活性为170.28 ± 8.68 U/mg，且在25°C时活性最高。时间序列HPSEC-RID和ESI-MS分析显示，在水解的早期阶段，与Nι4相关的信号较为显著，而与Nι2相关的信号则随着反应时间的延长而逐渐增强。为了提高重组产量，在OUC-CgiA-Lf-producing菌株中共同表达了维特毛草血红蛋白，获得了PLf-vgb3。在三个独立的5 L补料分批发酵中，胞外ι-角叉菜聚糖酶活性在120小时达到2663.31 ± 305.60 U/L，比相同条件下PLf-8的活性高5.67倍，并在144小时进一步达到3227.33 ± 122.35 U/L。这些结果表明，OUC-CgiA-Lf是一种有前景的酶候选品，可用于低DP ι-角叉菜聚糖低聚糖的受控制备，同时表明VHb共表达可能是提高其重组产量的一种有效策略。
引言
角叉菜聚糖（κ-角叉菜聚糖）是一种来源于红藻的硫酸化半乳聚糖，因其优良的凝胶和增稠性能而被广泛用作食品亲水胶体。与母体多糖相比，角叉菜聚糖低聚糖通常具有更高的溶解度和更广泛的功能特性，其生物活性受分子量、聚合度（DP）和硫酸化模式的影响较大（Zhang等，2023；Guo等，2022；Jiang等，2024；J. Li等，2026；Manseur等，2023；H. Wang & Zhu，2024；Xie等，2026）。例如，不同分子量的角叉菜聚糖低聚糖表现出不同的抗病毒活性（Tang等，2013），而硫酸基含量和分布可显著影响其抗炎等生物特性（Z. Li等，2024；Tang等，2023；Carlucci等，1997；Guo等，2018；Xu等，2012；Akbar & Mustari，2024；Akbar等，2026）。先前的研究主要集中在κ-角叉菜聚糖低聚糖的抗炎特性上，而非双糖重复单元中硫酸基更多的ι-角叉菜聚糖低聚糖。最近，ι-角叉菜聚糖衍生的低聚糖显示出依赖其分子大小和结构的生物活性；例如，DP8的ι-角叉菜聚糖低聚糖减少了脂多糖刺激的RAW264.7巨噬细胞中炎症介质的产生（Zhang等，2023）。这些结构依赖的特性凸显了开发可控方法制备具有定义聚合度的ι-角叉菜聚糖低聚糖的重要性，并为扩大用于其受控制备的酶工具箱提供了一般性的理论依据。
由于酶法水解具有温和的反应条件、催化选择性以及控制产品谱的潜力，它是制备角叉菜聚糖低聚糖的一条有吸引力的途径。目前，大多数研究集中在κ-角叉菜聚糖酶的研究上（Zhu等，2018），该酶能够降解硫酸基含量较低的多糖。相比之下，对硫酸基含量较高的ι-角叉菜聚糖酶的研究相对较少。ι-角叉菜聚糖酶（EC 3.2.1.157）主要属于糖苷水解酶家族82（GH82），特异性地裂解ι-角叉菜聚糖中的β-1,4糖苷键（Barbeyron等，2000）。在已表征的ι-角叉菜聚糖酶中，迄今报道的主要水解产物主要是ι-新角叉菜己糖（Nι6）和/或ι-新角叉菜四糖（Nι4）（Barbeyron等，2000；Hatada等，2011；Ma, Duan等，2013；Ma, Tan等，2013；Li等，2017；Shen等，2017）。因此，鉴定出具有不同产物谱的ι-角叉菜聚糖酶，特别是针对较低DP低聚糖的产物，将有助于扩展用于制备结构明确的ι-角叉菜聚糖低聚糖的酶工具箱。
除了催化特性外，高效异源生产对于角叉菜聚糖酶的实用性应用也至关重要。维特毛草血红蛋白（VHb）已被引入不同的微生物宿主，作为在氧限制条件下提高细胞氧气利用率的策略，并已被证明与多种代谢产物和生物产品的产量增加有关，包括头孢孢菌C、细菌纤维素和脂肪酸（F. Liu等，2026；DeModena等，1993；Chien等，2006；Setyawati等，2007；Liu等，2017）。这些观察结果表明，VHb共表达也可能是提高重组酶产量的有用策略（J. Liu等，2026；Y. Wang等，2025；Yang等，2025）。然而，其增强毕赤酵母中ι-角叉菜聚糖酶异源生产的潜力仍有待评估。
因此，本研究旨在鉴定和表征一种具有独特水解产物谱的新型ι-角叉菜聚糖酶OUC-CgiA-Lf，并探讨其在低DP ι-角叉菜聚糖低聚糖受控制备中的潜力。具体而言，我们表征了重组OUC-CgiA-Lf的生化特性，分析了其时间依赖性水解模式和产物组成，并利用结构建模和分子对接探讨了可能与其催化行为相关的结构特征。同时，我们评估了VHb共表达能否提高毕赤酵母中OUC-CgiA-Lf的异源生产，包括在5 L补料分批发酵系统中的评估。综合这些分析，旨在为制备定义的ι-角叉菜聚糖低聚糖提供一个新的酶候选品，并提供一种提高其重组产量的潜在策略。
分节摘要
OUC-CgiA-Lf的序列和结构分析
OUC-CgiA-Lf的开放阅读框（GenBank登录号：WP_101263299.1）长度为1,473 bp，编码一种491个氨基酸的蛋白质，包含一个预测的21个氨基酸的N端信号肽和一个GH82催化结构域（图1A）。与代表性κ-、ι-和λ-角叉菜聚糖酶的系统发育分析表明，OUC-CgiA-Lf聚集在GH82 ι-角叉菜聚糖酶分支内（图1B）。OUC-CgiA-Lf与来自Alteromonas macleodii的CgiA序列一致性约为46%，与
结论
总之，OUC-CgiA-Lf被鉴定和表征为一种在25°C时活性最高且具有独特时间依赖性水解产物谱的GH82 ι-角叉菜聚糖酶。Nι4在水解的早期和中期阶段较为显著，而Nι2则逐渐积累，并在长时间反应后成为主要的可检测低分子量产物。该产物谱与几种先前已表征的GH82 ι-角叉菜聚糖酶的产物谱不同，后者的
CRediT作者贡献声明
Kunpeng Gao：监督。Mohamed A. Balah：资金获取。Hamed I. Hamouda：数据管理。Chunhui Liu：撰写——审阅与编辑、验证、方法论、形式分析、数据管理。Yu Xin：撰写——原稿撰写。Haipeng Su：监督。Wenwen Song：方法论。Hong Jiang：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取。Haiyang Zhang：形式分析。Xiangzhao Mao：监督
未引用参考文献
Chevenier等，2023；Franz和Alban，1995；Liu等，2026；Ma等，2013；Poulet等，2023。
伦理声明
本文不包含任何作者进行的人类参与者或动物研究。
资助
本研究得到了国家重点研发计划（2024YFD2401604）、国家自然科学基金（32622101；325B2074）、山东省自然科学基金（ZR2024Y0054）、山东省泰山学者项目（tsqn202312099）以及博士后科学基金面上项目（GZC20251968）的支持。
利益冲突声明
? 作者声明他们不存在已知的、可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
Yu Xin|Chunhui Liu|Wenwen Song|Haipeng Su|Kunpeng Gao|Hamed I. Hamouda|Mohamed A. Balah|Haiyang Zhang|Hong Jiang|Xiangzhao Mao
