GSDMD依赖性细胞外Ca2?内流促进非IgE介导的肥大细胞脱颗粒

《Food Bioscience》：GSDMD-dependent extracellular Ca2+ influx promotes non-IgE-mediated mast cell degranulation

　　GSDMD 是非 IgE 介导的肥大细胞活化在非 IgE 型过敏反应中的关键介质。GSDMD 膜孔驱动胞外 Ca2? 内流，为肥大细胞脱颗粒所必需。GSDMD 介导的 Ca2? 内流促进肥大细胞过度活化而不导致焦亡性溶解。## 引言过敏反应（AnRs）和Ⅰ型超敏反应均可涉及肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒，导致组胺等介质的释放。尽管它们可能产生相似的急性临床表现，但其潜在机制截然不同。¹ 与Ⅰ型超敏反应不同，AnRs 可在首次暴露于触发因素时发生，不需要预先致敏或 IgE 参与。² 因此，AnRs 代表类似于即时超敏反应的响应，临床上类似于过敏反应，但通过不同的非 IgE 介导途径产生。尽管 AnRs 具有重要的临床意义，但其免疫学机制仍未完全明确。现有证据表明，AnRs 可通过几条主要途径发生。（1）受体介导的活化——某些物质可激活肥大细胞上的 G 蛋白偶联受体（GPCRs）并调节下游信号分子，包括 PLC-γ、PI3K 和 PLA₂，从而增加细胞内 Ca2?（[Ca2?]_i），引发肥大细胞脱颗粒和炎性介质释放。³ Compound 48/80 是一种经典的碱性促分泌剂，广泛用于实验诱导非 IgE 依赖性肥大细胞活化和脱颗粒。其肥大细胞活化作用与 Mas 相关 G 蛋白偶联受体信号有关，因此常被用作非 IgE 介导肥大细胞活化和过敏反应研究的参考刺激或阳性对照。^{4, 5} （2）补体活化——经典或替代补体途径的活化产生过敏毒素，结合肥大细胞上相应的受体并促进脱颗粒。⁶ （3）环氧化酶抑制——阿司匹林和其他非甾体抗炎药可抑制 COX-1 并改变花生四烯酸代谢，从而有利于促炎脂质介质的产生并促进肥大细胞活化。⁷ 尽管如此，AnRs 的精确分子机制仍有待进一步阐明。在 AnRs 中，肥大细胞是关键的效应细胞，其脱颗粒促进血管高通透性并释放与急性过敏性样表现相关的炎性介质。⁸ Ca2? 是肥大细胞活化中的关键第二信使，[Ca2?]_i 升高通过多条 Ca2? 依赖性信号通路调节颗粒外泌和炎性介质释放。⁹ 在肥大细胞和其他免疫细胞中，Ca2? 信号可参与下游 JAK/STAT 等通路，从而调节炎症反应。¹⁰ Ca2? 敏感性 GPCR 信号（包括涉及 GPRC6A 的通路）也被发现在调控储控 Ca2? 通道（SOCCs）和细胞 Ca2? 稳态方面发挥作用。¹¹ 在经典的 IgE 依赖性通路中，FcεRI 激活促进胞内 Ca2? 动员和胞外 Ca2? 内流，随后激活 Ca2? 依赖性信号通路，包括钙调神经磷酸酶–NFAT 轴，最终促进肥大细胞脱颗粒。¹²焦亡是一种程序性细胞死亡形式，在细胞炎症反应中发挥关键作用。¹³ 其分子机制涉及多条信号通路。在经典的 caspase-1 依赖性通路中，炎性小体传感器如 NLRP3、AIM2 和 Pyrin 识别病原体相关或损伤相关分子模式（PAMPs 或 DAMPs）。¹⁴ 这些传感器招募接头蛋白 ASC 和 caspase-1 组装炎性小体复合物，导致 caspase-1 活化。活化的 caspase-1 切割 Gasdermin D（GSDMD），促进膜孔形成并促进炎性细胞因子（包括 IL-1β 和 IL-18）的释放。¹⁵ 在非经典 caspase-1 非依赖性通路中，caspase-4、caspase-5 或 caspase-11 可直接切割 GSDMD 并促进焦亡信号传导。¹⁶ 焦亡通过促进病原体清除和免疫细胞募集对宿主防御至关重要；然而，过度或失调的焦亡活性可导致组织损伤和炎症性疾病的发病。在过敏性疾病研究中，越来越多的关注集中在程序性细胞死亡，特别是焦亡在炎症和过敏反应中的作用。¹⁷ 新兴证据表明，GSDMD 介导的焦亡信号对多种过敏性和炎症性疾病的发病有贡献，包括哮喘、过敏性结膜炎和动脉粥样硬化。¹⁸ NLRP3 炎性小体的活化也被发现在鼻黏膜炎症和过敏性鼻炎的加重中发挥作用，而用 MCC950 药理学抑制 NLRP3 可缓解这些炎症表现。¹⁹ 尽管将焦亡信号与过敏性疾病和 AnRs 联系起来的精确机制仍未完全理解，但不断积累的证据支持其在炎症疾病进展中的参与。在经典焦亡过程中，GSDMD 寡聚化形成膜孔，而 NINJ1 促进终末质膜破裂及随后胞内内容物的释放。^{20, 21} 重要的是，GSDMD 孔形成并不必然导致细胞立即溶解。[Ca2?]_i 升高可促进肥大细胞脱颗粒，同时也激活 ESCRT 依赖性膜修复机制以帮助维持质膜完整性和细胞存活。²² 因此，发生 GSDMD 孔形成的细胞在某些条件下可能保持非溶解性"过度活化"状态，而不是进展到终末焦亡性细胞死亡。²³总之，尽管 GSDMD 最为人所知的是作为焦亡性细胞死亡的成孔效应因子，GSDMD 活化并不必然导致完全的质膜破裂和终末细胞溶解。GSDMD 能否在不进展到明显焦亡的情况下通过 Ca2? 依赖性机制调节非 IgE 介导的肥大细胞活化仍不清楚。为解决这一问题，我们采用尼日利亚菌素作为 NLRP3 炎性小体激动剂以激活炎性小体/GSDMD 信号，并研究其对肥大细胞 Ca2? 动员和脱颗粒的影响。因此，本研究旨在确定 GSDMD 依赖性膜通透性增加是否有助于非 IgE 介导的肥大细胞活化，并阐明 GSDMD 活化、胞外 Ca2? 内流和肥大细胞脱颗粒之间的功能关系。## 各节摘要### 化学品尼日利亚菌素购自源叶生物科技（中国上海），溶于二甲基亚砜（DMSO），4°C 保存备用。Compound 48/80（多聚对-甲氧基苯乙基甲基胺）和对硝基苯酚-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺苷（PNP-NAG）购自 MedChemExpress（中国上海）。Fluo-8 和碘化丙啶（PI）购自 Abcam（中国上海）。### 试剂和材料DMSO、含 Tween 20 的 Tris 缓冲盐溶液（TBST）、牛血清白蛋白（BSA）、柠檬酸盐缓冲液和碳酸氢钠。### 尼日利亚菌素在体内诱导急性血管高通透性为评估尼日利亚菌素能否在体内引发急性非 IgE 介导的过敏反应，将 BALB/c 小鼠以 2.5 μg/kg 的剂量经尾静脉注射给予尼日利亚菌素，该剂量基于初步实验优化选择。血管通透性通过伊文思蓝渗出进行评估。与对照组相比，尼日利亚菌素处理显著增加了耳组织中伊文思蓝的渗出，表明血管通透性增强。### 讨论非 IgE 介导的 AnRs 造成重要的诊断和临床挑战，因为其急性表现可非常类似于 IgE 介导的过敏反应，尽管它们通过不同的机制产生。³⁴ 尽管 AnRs 的分子基础仍未完全理解，但肥大细胞被认为是核心效应细胞，多种非 IgE 介导途径可直接促进其活化和脱颗粒。例如，盐酸小檗碱诱导的 AnRs 已被### 结论本研究证明尼日利亚菌素诱导的炎性小体/GSDMD 信号活化通过 Ca2? 依赖性机制促进非 IgE 介导的肥大细胞脱颗粒。在 LAD2 细胞、RBL-2H3 细胞和 PCMCs 中，尼日利亚菌素增强了 β-葡萄糖醛酸苷酶和组胺的释放并增加了胞内 Ca2? 动员，而去除胞外 Ca2? 显著减弱了脱颗粒反应。实时 Fluo-8/PI 监测进一步显示 Ca2? 升高先于可检测### CRediT 作者贡献声明**张朵朵**：可视化、方法学、形式分析。**关双**：写作——审阅与编辑、写作——原稿、可视化。**史晓雷**：方法学、形式分析。**邓旭明**：可视化、形式分析。**姚欣雨**：写作——审阅与编辑、写作——原稿、验证、方法学、形式分析。**刘美彤**：写作——原稿、验证、方法学、概念化。### 试验注册不适用。### 利益冲突作者声明不存在任何已知可能影响本文报告工作的竞争性经济利益或个人关系。### 数据和材料的可获得性数据可从通讯作者处合理申请获得。### 资助来源本研究由中国国家重点研发计划（批准号：2023YFD1800903）资助。### 利益冲突声明作者声明不存在任何已知可能影响本文报告工作的竞争性经济利益或个人关系。姚欣雨|刘美彤|史晓雷|邓旭明|张朵朵|关双