糖基转移酶UGTPg29的半理性工程实现了莱鲍迪苷M和M2的高效生物合成

《Food Chemistry》：Semirational engineering of glycosyltransferase UGTPg29 enables efficient biosynthesis of rebaudioside M and M2

　　

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  半理性工程提高了UGTPg29对Reb D的生产效率。
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  UGTPg29_{C41I/A140S/A342L}对Reb A的k_cat/K_m提高了175.9%。
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  UGTPg29_{C41I/A140S/A342L}在50 °C下3小时后仍保留85.18%的活性。
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  通过一锅三酶反应，将82.73 mM的Reb A转化为62.74 mM的Reb M。
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  通过一锅三酶反应，将62.05 mM的Reb A转化为41.01 mM的Reb M2。

引言

随着过量蔗糖摄入导致的代谢性疾病日益普遍，开发更健康天然甜味剂的需求迫在眉睫（Libik-Konieczny等，2021）。甜菊糖苷（SGs）是从甜叶菊（Stevia rebaudiana）中提取的零卡路里甜味剂，因其强烈的甜味和潜在的健康益处而成为蔗糖的高潜力替代品（Hellfritsch等，2012；Orellana-Paucar，2023）。迄今为止，已鉴定出超过60种SGs，它们的甜味和理化性质因甜醇骨架C-13和C-19位所连接的糖基的类型、数量及连接方式不同而异（Ceunen & Geuns，2013；Libik-Konieczny等，2021）。与早期发现的甜菊糖苷A（RebA）等相比，甜菊糖苷M（RebM）具有更纯净的甜味，苦味最小，感官特性最接近蔗糖（Tao & Cho，2020）。其异构体甜菊糖苷M2（RebM2）在C-19位具有独特的β-1,6糖苷键（Prakash等，2014）。这种独特的糖基化模式可能赋予不同的感官特性，凸显了RebM2作为SG甜味剂进一步开发的潜力。

RebM在S. rebaudiana中的天然含量相对较低（Ceunen & Geuns，2013），而RebM2迄今是通过酶法转化甜菊糖苷D（RebD）等SG前体获得的（Chen等，2024；Yang等，2024）。由此产生的高生产成本严重限制了其大规模商业应用。相比之下，RebA在叶片中含量丰富，约占干重的4%–10%。其稳定且易于获取的供应使其成为生物转化为RebM和RebM2等高附加值糖苷的理想前体（Wang等，2023）。具体来说，在特定的尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）依赖型糖基转移酶（UGTs）的催化下，RebA可以通过将β-D-葡萄糖基转移到C-19连接的葡萄糖残基的2-羟基上转化为RebD，从而形成β-1,2糖苷键。随后，RebD可以在C-19糖链上进一步糖基化形成RebM或RebM2。因此，实现RebA向RebD的高效转化已成为该生物合成途径中的关键步骤。

已有报道可将RebA转化为RebD的多种UGTs，包括来自S. rebaudiana的UGT91D2（Zhang, Yang等，2021）、来自番茄（Solanum lycopersicum）的UGTSL2（Chen等，2018）、来自水稻（Oryza sativa）的EUGT11（Wang等，2020）以及来自枯草芽孢杆菌168（Bacillus subtilis 168）的YojK（Guo等，2022）。然而，催化效率低、区域选择性不足或副产物生成限制了其实用性。所得RebD随后由专门的下游UGTs转化为RebM或RebM2。对于RebM的合成，UGT76G1是S. rebaudiana的经典酶，可催化RebD的C-19 β-1,3葡萄糖基化（Olsson等，2016），但其对C-13的偏好限制了该反应。UGT76G4是UGT76G1的天然变体，通过显著的区域C-19选择性和对RebD更高的转化效率克服了这一限制（Wang等，2025）。对于RebM2的合成，工程化的NtUGT_{F72L/L123P/L157P}可催化RebD的C-19 β-1,6葡萄糖基化（Chen等，2024）。

在我们之前的研究中，来自人参（Panax ginseng）的糖基转移酶UGTPg29被工程化改造以改善其对人参皂苷Rh2糖基化的稳定性和活性（He等，2025）。该酶将葡萄糖基转移到Rh2的C-3位葡萄糖基上，形成β(1 → 2)糖苷键，从而将Rh2转化为Rg3（Wang等，2015）。由于这种连接方式与RebA转化为RebD过程中形成的连接方式相似（图S1），UGTPg29被认为是有前景的RebA糖基化催化剂。我们首先确认了其对RebA的糖基化活性。然而，有利于Rh2糖基化的突变并不一定增强RebA的转化。因此，我们通过结构引导的半理性工程重新改造了UGTPg29以作用于RebA，生成了催化效率和热稳定性均得到提高的三重突变体UGTPg29_{C41I/A140S/A342L}。该突变体与UGT76G4或NtUGT_{F72L/L123P/L157P}以及拟南芥（Arabidopsis thaliana）蔗糖合酶（AtSuSy）联合使用进行原位UDPG再生，建立了分别从丰富的RebA生产RebM和RebM2的两个级联系统，为RebD合成提供了稳定的催化剂，并为高附加值SGs提供了高效路线。

各节摘要

化学品

所有化学品均购自国药集团化学试剂有限公司（上海，中国）和赛庚生物科技（上海，中国）。甜菊糖苷（包括RebA、RebD、RebM和RebM2）由沃天药业（诸城，中国）提供。除另有说明外，所有其他试剂均为分析纯。

质粒与菌株构建

pET-AtSuSy_UGTPg29质粒在之前的研究中构建（He等，2025）。该质粒包含编码来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）蔗糖合酶（AtSuSy）的密码子优化基因，

UGTPg29对RebA的糖基化

来自人参（Panax ginseng）的UGTPg29被鉴定为负责催化人参皂苷Rh2的C-3位葡萄糖基糖基化，形成β(1 → 2)糖苷键，从而产生人参皂苷Rg3（He等，2025；Wang等，2015）。为了确定UGTPg29是否能够催化RebA的糖基化形成RebD（图1A），我们在大肠杆菌（E. coli）BL21(DE3)中异源表达了该酶。与其他植物来源的糖基转移酶一致（Chen等，2018；Shu等

结论

在本研究中，我们证明了UGTPg29能够催化RebA的区域选择性糖基化以产生RebD。利用结构引导的半理性工程，我们生成了催化效率和热稳定性同时增强的三重突变体UGTPg29_{C41I/A140S/A342L}，其显著延长的半衰期证明了这一点。分子对接和分子动力学模拟表明，联合突变重塑了局部相互作用网络并改变了构象

CRediT作者贡献声明

Kai Chen：撰写–初稿，方法论，形式化分析。Yuan Liao：验证，软件。Boyuan Zhang：可视化，方法论，调查。Jiajie Chen：可视化，方法论，调查。Weicai Song：资源，项目管理，方法论。Kecai Chen：资源，项目管理，方法论。Liping Zhu：调查，资金支持。Yan Li：撰写–审阅与编辑，监督，资金支持。Honghua Jia：撰写–审阅与编辑，

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所述工作。

致谢

本工作得到了东泰海瑞生物科技有限公司、江苏省先进生物制造协同创新中心以及江苏省产学研合作计划（PAPD）的资助。

Kai Chen|Yuan Liao|Boyuan Zhang|Jiajie Chen|Weicai Song|Kecai Chen|Liping Zhu|Yan Li|Honghua Jia