整合转录组与代谢组学分析鉴定云岭与努比亚山羊背最长肌肉质差异的分子特征

《Food Chemistry: Molecular Sciences》：Integrated transcriptomic and metabolomic analyses identify molecular signatures associated with meat quality differences between Yunling and Nubian goats

　　

云岭山羊表现出较努比亚山羊更低的剪切力和更高的pH_45min，而pH_24h无显著差异。整合多组学分析鉴定出与品种相关的剪切力和pH_45min变异相关的独特分子特征。与碳水化合物和能量代谢相关的候选基因以及以磷脂为主的代谢物谱与观察到的肉质差异相关。

肉品质是影响消费者接受度和羊肉经济价值的重要因素，嫩度、色泽与保水性等性状受到肌肉结构、脂质沉积和宰后代谢的共同影响。宰后肌肉因供氧中断而转向无氧糖酵解，伴随乳酸积累和pH下降，pH下降速率和程度直接影响嫩度等品质。不同山羊品种在嫩度等方面存在较大差异，可能源于遗传背景和肌肉特性的不同。云岭山羊（Yunling goat）是适应中国西南部环境的地方品种，努比亚山羊（Nubian goat）则广泛用于肉用生产。在相同饲养条件下比较二者，有助于解析品种间肉质差异的分子基础。尽管已有山羊多组学研究，但品种相关肉质差异的分子特征仍不完全清楚。研究人员假设两品种的肉质差异伴随不同的肌肉转录组和代谢组谱，并利用多组学整合分析加以验证。

这项研究从云南省双柏县响洪农牧场选取12只24月龄健康山羊，包括云岭羊6只和努比亚羊6只，每品种公母各3只，统一舍饲管理。研究人员采集背最长肌（longissimus dorsi, LD）分别用于肉质测定、转录组测序和广泛靶向代谢组学。结果显示，与努比亚羊相比，云岭羊剪切力（shear force）显著降低（38.858±4.497 N vs 53.880±6.845 N），pH_45min显著升高（6.723±0.168 vs 6.383±0.139），而pH_24h无显著差异。这一表型差异为后续分子鉴定奠定了基础。通过整合差异表达分析、差异代谢物分析和加权基因共表达网络分析（WGCNA），研究人员鉴定出与剪切力和pH_45min相关的候选基因与代谢物。这些结果说明，品种相关肉质差异与多个分子层面的变化相关，而非单一通路改变，为山羊肉质改良提供了候选分子标记。

本研究用到的主要关键技术方法如下：样本队列来自云南省双柏县响洪农牧场的12只24月龄山羊（云岭6只、努比亚6只）。利用Illumina NovaSeq 6000平台进行RNA测序获得转录组；利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行广泛靶向代谢组学检测；通过HISAT2比对到山羊参考基因组（ARS1），用DESeq2筛选差异表达基因；基于MetWare数据库鉴定代谢物，并通过OPLS-DA和VIP值筛选差异代谢物；使用WGCNA构建基因和代谢物共表达网络并计算模块与性状的相关性；将差异分子与性状相关模块取交集后进行GO/KEGG富集分析。

结果部分总结如下：

3.1 云岭与努比亚山羊的肉质性状差异：通过双因素方差分析比较两品种，发现云岭羊剪切力显著低于努比亚羊，pH_45min显著高于努比亚羊，而pH_24h、保水性和多数肉色参数无显著差异，仅a*24h在云岭羊中较高。这表明两品种在嫩度和早期pH上的差异最突出。

3.2 差异基因表达和代谢组谱：RNA测序分析共获得241个差异表达基因（160个上调、81个下调），GO和KEGG富集显示它们涉及氧化还原酶活性、HIF-1信号通路、丙酮酸代谢等。代谢组学分析鉴定出59个差异代谢物，其中甘油磷脂类占69.49%，富集于甘油磷脂代谢等脂质通路。这表明品种间存在明显的转录和代谢差异。

3.3 所有表达基因的WGCNA和功能富集：基于转录组构建共表达网络，鉴定出19个模块。cyan模块与剪切力正相关（r=0.84），brown模块与剪切力负相关（r=-0.58），turquoise模块与pH_45min负相关（r=-0.59）。brown模块富集于氧化磷酸化、丙酮酸代谢和TCA循环，turquoise模块富集于自噬、溶酶体和FoxO信号通路等。这确定了与目标性状相关的基因模块。

3.4 所有检测代谢物的WGCNA和通路富集：代谢物共表达网络得到13个模块。black模块与剪切力负相关（r=-0.73）且与pH_45min正相关（r=0.73），green模块与剪切力正相关（r=0.67）。black模块富集于甘油磷脂代谢、鞘脂代谢和不饱和脂肪酸生物合成，green模块富集于色氨酸代谢等。这表明剪切力与pH_45min共享一个代谢模块。

3.5 与性状相关的候选分子特征的鉴定和通路分析：将与剪切力正相关的cyan模块未发现差异基因重叠，但与剪切力负相关的brown模块有35个差异基因重叠（如NDUFA5、ND6、TFRC等），富集于HIF-1信号通路、氧化磷酸化等。与pH_45min负相关的turquoise模块有30个差异基因重叠（如HMOX1、PFKFB3等），富集于HIF-1信号通路和果糖/甘露糖代谢。代谢物方面，与剪切力和pH_45min相关的black模块有26个差异代谢物重叠，以磷脂类为主，富集于逆行内源性大麻素信号、亚油酸代谢和花生四烯酸代谢。这些交集分析进一步缩小了候选分子范围。

3.6 跨组学相关性和候选分子特征整合：Pearson相关性分析显示，剪切力相关候选基因TFRC与多个磷脂代谢物显著相关，pH_45min相关候选基因PFKFB3与PE和LNAPE等显著相关。整合图谱显示，brown基因模块和turquoise基因模块分别关联剪切力和pH_45min，而black代谢模块与两个性状均关联，但两组学间共享通路有限。这说明转录与代谢层面提供互补信息。

在讨论部分，研究人员指出早期宰后pH下降是肉质发育的重要影响因素。本研究中两品种pH_45min有差异而pH_24h无差异，提示差异主要体现在早期pH状态。与pH_45min相关的turquoise模块基因富集于HIF-1信号通路，其中PFKFB3是已知的糖酵解调控因子，HMOX1与细胞应激相关。这些基因的表达差异被解释为与pH_45min品种差异相关的转录特征，而非直接因果证据。与剪切力相关的brown模块基因涉及氧化磷酸化、HIF-1信号和产热，候选基因NDUFA5、ND6和TFRC与线粒体呼吸链和铁代谢相关，提示线粒体-能量代谢-铁相关特征与剪切力差异相关，但未直接测定线粒体功能或氧化还原状态。代谢层面，黑色模块候选代谢物以磷脂为主，但富集通路却是与不饱和脂肪酸相关的逆行内源性大麻素信号等。跨组学通路比较显示仅剪切力分析中逆行内源性大麻素信号在两组学中均显著富集，pH_45min分析中无共享通路。基因-代谢物相关性可能反映品种间共变而非调控关系。研究局限包括样本量小、pH时间点少、未测定糖酵解通量、线粒体功能及未用qRT-PCR验证候选基因。

研究结论翻译：本研究描述了云岭与努比亚山羊之间肉质性状及相关分子谱的品种差异。云岭羊的剪切力较低、pH_45min较高，而pH_24h无显著差异。将差异分析与性状相关的WGCNA模块整合，优先确定了与这些表型差异相关的候选分子特征。与pH_45min相关的特征主要以HIF-1和碳水化合物代谢相关转录特征为特征，包括PFKFB3和HMOX1；与剪切力相关的特征包括线粒体、能量代谢和铁相关基因，如NDUFA5、ND6和TFRC。在代谢物水平，磷脂种类是品种相关和性状相关分子谱的重要组成，候选代谢物集还富集于若干脂质相关通路。尽管转录组和代谢组候选集在通路水平的重叠有限，基因-代谢物相关性揭示了选定转录特征与磷脂相关特征之间的共变。总之，这些发现为品种相关肉质差异提供了描述性多组学特征，并确定了供进一步研究的候选分子特征。其生物学作用及与肉质预测或育种的潜在相关性需在更大的独立群体和针对性功能分析中验证。