《Food Chemistry: X》：Ultrafiltration matrix modulates metabolism and flavor profiles in natural cheese: Insights from microbial and metabolomic profiling
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本研究整合了非靶向代谢组学（untargeted metabolomics）、挥发性物质谱分析（volatile profiling）和16S rRNA扩增子测序技术，旨在表征超滤（UF）基质诱导的天然奶酪代谢与风味差异，并探索细菌群落、非挥发性代谢物与挥发性
本研究整合了非靶向代谢组学（untargeted metabolomics）、挥发性物质谱分析（volatile profiling）和16S rRNA扩增子测序技术，旨在表征超滤（UF）基质诱导的天然奶酪代谢与风味差异，并探索细菌群落、非挥发性代谢物与挥发性风味化合物之间的潜在关联。研究人员构建了微生物-代谢物相关性网络，以揭示UF基质环境下微生物群落、代谢物与挥发性化合物之间的内在联系，从而为理解UF奶酪的代谢与风味特征提供理论基础。结果表明，UF基质显著促进了鲜味和甜味氨基酸的富集，脂质和氨基酸类物质是响应UF基质变化的核心组分。11种关键挥发性化合物的定向变化定义了UF奶酪独特的风味轮廓，其中乳球菌属（Lactococcus）和链球菌属（Streptococcus）驱动了特定的风味生物转化过程。
研究背景与目的
传统奶酪加工过程中会产生大量乳清，导致优质乳清蛋白流失，同时排放高生化需氧量（BOD）和化学需氧量（COD）的废水，给环境带来沉重负担并增加生产成本。超滤（UF）膜分离技术的引入为改善乳成分利用率提供了可行途径，可通过浓缩乳蛋白提高乳清蛋白在奶酪基质中的截留率，进而提升奶酪产量。然而，UF引起的浓缩效应会显著改变牛乳基质的组成与理化性质，包括缓冲容量升高、水分活度降低及底物失衡等，这些变化可能对发酵过程中的微生物代谢和风味相关生化过程产生影响。目前关于UF奶酪的研究主要集中在理化特性与技术性能方面，而UF基质环境如何同步影响微生物群落、非挥发性代谢物及挥发性风味化合物的系统信息仍然有限。因此，本研究整合非靶向代谢组学、挥发性物质谱分析和16S rRNA扩增子测序，系统揭示UF基质驱动的奶酪代谢与风味变化，并构建微生物-代谢物相关性网络，为理解UF奶酪的代谢与风味特征提供理论依据。
研究方法
研究人员采用2×2析因设计，以奶酪基质（对照与UF）和发酵剂菌种（CH21.31与R707）为两个实验因素，共设置四个处理组：CC21.31、CC707、UF21.31和UF707。关键技术方法包括：采用压力驱动膜系统进行牛乳超滤浓缩（截留分子量10 kDa，浓缩倍数5倍）；利用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）定量游离氨基酸（FAAs）；运用非靶向代谢组学（UPLC-MS）结合亲水作用色谱（HILIC）和反相液相色谱（RPLC）两种模式进行代谢物鉴定；采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）进行挥发性有机化合物（VOCs）检测并计算气味活度值（OAV）；通过Illumina NovaSeq 6000平台对细菌16S rRNA基因V3-V4区进行扩增子测序以分析微生物群落结构；利用Spearman相关系数进行微生物-代谢物-风味物质的相关性分析。
研究结果
3.1 理化性质：各组间蛋白质、脂肪、灰分和水分含量虽存在统计显著差异，但均处于相对较窄范围内（蛋白质13.69–15.03 g/100g，脂肪16.28–20.02 g/100g）。UF与对照组间的成分差异被视为UF基质效应的组成部分而非可完全标准化的独立变量。
3.2 游离氨基酸谱：共鉴定出21种游离氨基酸（FAAs），总含量范围为433.27–1005.43 mg/kg，其中UF707组总含量最高。UF奶酪的总FAA水平显著高于对应对照组（p<0.05）。UF基质使鲜味和甜味氨基酸含量分别显著富集3.5–4.9倍和1.0–2.5倍（p<0.05）。谷氨酸、酪氨酸、赖氨酸和苏氨酸等在UF组中显著升高。双因素方差分析显示所有定量FAA均存在显著的基质效应，表明UF基质对FAA积累产生广泛影响。
3.3 非靶向代谢组学与基质相关代谢变化：共注释3952种代谢物，其中脂质占比最高（43.21%–52.41%），其次为氨基酸及其衍生物（19.04%–23.10%）。UF奶酪中碳水化合物相对丰度较对照组显著下降62.88%–63.28%，这与UF过程中乳糖随透过液流失有关。主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）均清晰区分UF与对照组。基于筛选标准（FC≥2或≤0.5，VIP>1，p<0.05，FDR校正q<0.05），UF21.31 vs CC21.31共鉴定816种差异代谢物（347种上调，469种下调），UF707 vs CC707共鉴定794种差异代谢物（327种上调，467种下调）。
3.4 差异代谢物富集与代谢通路变化：层次聚类分析显示UF组中磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰肌醇（PI）等脂质类代谢物丰度较高，而大多数碳水化合物代谢物在对照组中丰度更高。KEGG通路富集分析表明，D-氨基酸代谢、淀粉与蔗糖代谢、半乳糖代谢、缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸生物合成等通路在两个比较组中均显著富集（p<0.05），碳水化合物代谢和氨基酸生物合成是共同的差异通路。
3.5 挥发性风味化合物组成：共检测到100种挥发性化合物。UF奶酪中酸类浓度较对照组显著降低59.09%–68.66%（p<0.05），而醇类、酮类、内酯类和芳香烃类含量显著升高（p<0.05）。PCA和PLS-DA均显示UF与对照组间挥发性轮廓存在明显差异。基于VIP>1共筛选出46种（CC21.31 vs UF21.31）和45种（CC707 vs UF707）差异挥发性化合物。
3.6 气味活度值：基于OAV>1的标准，四组中分别有23、24、22和20种潜在气味活性化合物。2-壬酮在所有组中OAV最高，与发酵乳香气轮廓发展相关。UF组中苯甲醇和2-庚酮的OAV显著高于对照组。双乙酰（acetoin）在CC707组中OAV最高（14.49），与链球菌产香特性一致。
3.7 潜在关键气味活性化合物筛选：基于VIP>1且OAV>1的标准，共鉴定出11种UF与对照奶酪间的潜在关键差异气味活性化合物。UF基质与较高的甲基酮类、内酯类和特定醇类水平相关联，这种组成转变以水果香和奶油香描述符相关化合物水平升高为特征。双因素方差分析显示9/10种可分析关键挥发性化合物存在显著基质效应。
3.8 微生物群落结构：厚壁菌门（Firmicutes）为优势菌门（相对丰度99.80%–99.93%）。属水平上，CC21.31和UF21.31组中以链球菌属（Streptococcus）为优势菌（90.27%和78.57%），而CC707和UF707组中以乳球菌属（Lactococcus）为优势菌（73.07%和99.04%）。α多样性分析显示UF21.31组的Shannon和Simpson指数较CC21.31分别升高58.31%和81.87%（p<0.05），而UF707组较CC707分别下降85.67%和90.62%（p<0.05）。β多样性分析（PCoA和NMDS）及层次聚类均显示，与基质相关的代谢和风味差异相比，发酵剂菌种类型是决定微生物群落相似性的主要因素。
3.9 微生物、代谢物与风味特征相关性分析：Spearman相关性分析显示，Lactococcus的相对丰度与多种复杂脂质呈显著正相关或负相关，而Streptococcus则呈现相反的关联模式，表明两菌属在脂质代谢中扮演不同角色。
讨论与结论
本研究表明，UF基质通过改变微生物代谢环境显著重塑了天然奶酪的代谢与风味轮廓。UF奶酪的特征在于鲜味和甜味氨基酸的显著富集、碳水化合物代谢物的减少以及脂质和氨基酸衍生物的积累。在挥发性风味方面，UF基质与较高的甲基酮类、内酯类和特定醇类水平相关，形成了以水果香和奶油香为特征的独特风味轮廓。微生物群落分析显示，发酵剂菌种类型是驱动微生物组成的主要因素，而Lactococcus和Streptococcus与特定代谢物和风味化合物之间存在显著相关性。值得注意的是，本研究仅考察了7天成熟期这一单一时间点，UF相关的代谢与风味差异在延长成熟过程中可能被维持、减弱或进一步增强，这需要通过包含多个成熟阶段的纵向研究来阐明。总体而言，该研究从多组学角度系统揭示了UF基质驱动的奶酪代谢与风味形成机制，为优化UF奶酪生产工艺和品质调控提供了重要的理论依据。
