《Food Chemistry: X》：Integrated volatilomics and lipidomics reveal aroma-related volatile and lipidomic changes associated with
Enterococcus faecalis JM263 supplementation in yak meat
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牦牛（Bos grunniens）是青藏高原最具代表性的家畜物种。长期生活在海拔3000米以上的寒冷、低氧和高紫外线环境中，牦牛形成了独特的生理和代谢特征以及优良的肉质特性。牦牛肉是高原牧民重要的动物蛋白来源，以其高蛋白、低脂肪和低胆固醇含量以及丰富的矿物质组
牦牛（Bos grunniens）是青藏高原最具代表性的家畜物种。长期生活在海拔3000米以上的寒冷、低氧和高紫外线环境中，牦牛形成了独特的生理和代谢特征以及优良的肉质特性。牦牛肉是高原牧民重要的动物蛋白来源，以其高蛋白、低脂肪和低胆固醇含量以及丰富的矿物质组成而具有突出的营养价值。与普通牛肉相比，牦牛肉表现出独特的感觉特征和营养特性，这有助于其与其他牛肉产品的差异化。这些独特的风味特征赋予牦牛肉可观的市场潜力和消费者吸引力，在国内和国际高端肉类市场受到越来越多的关注。
风味是决定肉类品质和消费者接受度的关键因素。肉类风味的形成是一个复杂的生化过程，与脂质氧化、氨基酸代谢、碳水化合物降解及其相互作用产生的挥发性化合物的生成密切相关。在烹饪或储存过程中，脂质分解产生醛类、酮类、醇类和羧酸类化合物，而美拉德反应生成杂环化合物（如吡嗪类、噻吩类和吲哚类）；这些化合物共同构成肉类风味的基础。因此，脂质代谢模式和氨基酸转化途径的差异可能导致不同物种、品种和饲养系统之间香气相关特征的差异。
随着国内外对牦牛肉需求的增长，传统放牧系统日益无法满足规模化生产和稳定供应的需要。为此，青藏高原一直在改进舍饲育肥以提高生产效率、缩短育肥周期并确保稳定的肉类供应。然而，许多研究和生产经验表明，与传统放牧相比，舍饲喂养会对牦牛肉的感觉品质产生不利影响，尤其是风味方面。这主要归因于圈舍日粮的同质性、体力活动减少以及代谢模式的变化，这些因素改变了脂肪沉积和肌肉代谢途径，从而影响挥发性风味化合物的形成。这一问题已成为牦牛肉产业高质量发展的主要制约因素之一。
近年来，营养调控和微生态干预为应对舍饲系统下肉质下降问题提供了新策略。肠道微生物群在能量代谢、脂质沉积、免疫调节和宿主代谢稳态中发挥重要作用。益生菌补充与畜禽肠道微生态、代谢状态和肉质相关特征的变化有关。在反刍动物中，益生菌补充也与瘤胃发酵模式、营养利用效率、肌肉脂质组成和代谢活性的变化相关。因此，益生菌应用可能代表一种潜在营养策略，用于探索与舍饲牦牛生产中香气相关代谢特征的关联。
粪肠球菌（Enterococcus faecalis）是一种兼性厌氧乳酸菌，广泛分布于动物肠道、发酵食品和自然环境中。它具有较强的环境适应性和代谢多样性。近年来，粪肠球菌因其对胃酸和胆汁盐的耐受性以及在纤维素降解、乳酸产生和次级代谢调控中的潜在作用，在动物生产中受到越来越多的关注。先前研究表明，粪肠球菌可以改善反刍动物瘤胃微生物群落结构，优化氮代谢，促进挥发性脂肪酸产生，还可通过调节脂肪酸组成和抗氧化酶活性间接影响肉类品质。此外，粪肠球菌已被报道可抑制病原菌并增强宿主免疫力，这为其在青藏高原寒冷低氧条件下牦牛生产中的潜在应用提供了理论基础。研究人员从西藏林周县自由放牧牦牛肠道中分离出一株潜在益生菌株粪肠球菌JM263，并系统评价了其益生特性。粪肠球菌JM263对模拟胃液和肠液以及胆汁盐具有耐受性，具有抗菌和抗氧化活性、较强的纤维降解能力以及对体外瘤胃发酵的有利影响。最近一项为期60天的山羊饲喂研究初步提供了其在高精料日粮条件下功能效力和耐受性的体内证据。
然而，关于粪肠球菌在牦牛肉品质和风味形成中的作用及机制的研究仍然有限。大多数现有研究集中于其对生长性能、免疫功能和肠道健康的影响，而其对肉类风味形成的直接影响尚未被系统阐明。特别是，结合电子鼻（electronic nose, E-nose）、风味组学（flavoromics）和脂质组学（lipidomics）技术的整合多组学方法在此背景下很少被应用。电子鼻是一种模拟人类嗅觉系统的分析工具，可以快速客观地评估肉类的整体风味特征，适用于宏观风味比较。风味组学能够对肉类中关键挥发性化合物进行定性和定量分析，揭示风味形成的化学基础。脂质组学则提供对脂质组成和代谢网络的全面理解，阐明脂质在风味生成中的核心作用。整合这三种技术为表征与粪肠球菌JM263补充相关的香气相关分子变异和探索潜在代谢关联提供了一个多维框架。
因此，本研究系统调查了青藏高原育肥牦牛背最长肌在日粮补充粪肠球菌JM263后香气相关的变化。通过电子鼻分析表征仪器香气相关特征，通过风味组学表征挥发性特征，并通过脂质组学表征脂质组特征。这些分析共同提供了一个整合框架，用于探索粪肠球菌JM263补充与牦牛肉香气相关挥发性特征和脂质来源香气前体代谢的关联。这些发现为牦牛肉的香气相关化学特征提供了新见解，并为益生菌在舍饲牦牛生产中的应用和优质高原肉制品开发提供了理论和实践基础。
一、研究背景与问题提出
牦牛（Bos grunniens）是青藏高原最具代表性的家畜物种，长期适应海拔3000米以上的寒冷、低氧和高紫外线环境，形成了独特的生理代谢特征和优良肉质特性。牦牛肉以高蛋白、低脂肪、低胆固醇和丰富矿物质含量著称，其独特的风味特征赋予其显著的市场潜力和消费者吸引力。风味是决定肉类品质和消费者接受度的关键因素，其形成是脂质氧化、氨基酸代谢、碳水化合物降解及其相互作用产生挥发性化合物的复杂生化过程。
随着国内外对牦牛肉需求的增长，传统放牧系统已难以满足规模化生产和稳定供应的需要，青藏高原因此推广舍饲育肥以提高生产效率。然而，研究表明舍饲喂养相比传统放牧会对牦牛肉的感觉品质产生不利影响，尤其是风味方面。这主要归因于圈舍日粮同质性、体力活动减少和代谢模式变化，导致脂肪沉积和肌肉代谢途径改变，进而影响挥发性风味化合物的形成。这一问题已成为制约牦牛肉产业高质量发展的主要瓶颈。
近年来，营养调控和微生态干预为改善舍饲系统下肉质下降提供了新策略。肠道微生物群在能量代谢、脂质沉积、免疫调节和宿主代谢稳态中发挥重要作用。益生菌补充已被证实与畜禽肠道微生态、代谢状态和肉质相关特征的变化有关。粪肠球菌（Enterococcus faecalis）作为一种兼性厌氧乳酸菌，具有强环境适应性和代谢多样性，可改善反刍动物瘤胃微生物群落结构、优化氮代谢、促进挥发性脂肪酸产生，并通过调节脂肪酸组成和抗氧化酶活性间接影响肉类品质。研究人员从西藏林周县自由放牧牦牛肠道中分离出潜在益生菌株粪肠球菌JM263，系统评价了其益生特性，包括对模拟胃肠液和胆汁盐的耐受性、抗菌和抗氧化活性、纤维降解能力及对体外瘤胃发酵的有利影响。然而，粪肠球菌对牦牛肉品质和风味形成的作用及机制研究仍十分有限，尤其是整合电子鼻（electronic nose, E-nose）、风味组学（flavoromics）和脂质组学（lipidomics）的多组学方法在此背景下鲜有应用。因此，本研究旨在系统探究粪肠球菌JM263补充对育肥牦牛背最长肌香气相关特征的影响及其脂质代谢关联。
二、研究内容与结论
本研究在西藏日喀则甲措雄乡牛羊产业园区实验基地开展，试验地点海拔约4000米。选取12头健康公牦牛（280±15.36 kg），随机分为对照组（CON，饲喂基础日粮）和粪肠球菌组（EFA，基础日粮中添加0.5 g/kg粪肠球菌JM263，1×108 CFU/g），每组6头。试验期共75天，包括15天适应期和60天正式试验期。屠宰后采集第9至12肋间左半胴体背最长肌样本，液氮速冻后于-80°C保存，用于电子鼻分析、GC-MS挥发性代谢组学分析和LC-MS/MS脂质组学分析，每组6个样本代表6个独立生物学重复。
三、关键技术方法
本研究主要采用三项核心技术：一是电子鼻检测技术，使用PEN3电子鼻（AIRSENSE Analytics GmbH, Schwerin, Germany）采集肌肉样本的仿生嗅觉数据，每个生物学样本进行3次独立技术重复测量；二是GC-MS半定量挥发性代谢组学分析，采用顶空固相微萃取（SPME）结合Agilent 8890气相色谱-7000E三重四极杆质谱联用系统，以3-己酮-2,2,4,4-d?为内标进行半定量分析；三是LC-MS/MS半定量脂质组学分析，采用ExionLC? AD超高效液相色谱系统偶联QTRAP? 6500+质谱系统，在正负离子模式下进行多反应监测（MRM）扫描，使用脂质类别匹配内标进行信号校正和半定量比较。
四、研究结果
4.1 电子鼻区分两组牦牛肉的香气相关挥发性特征
电子鼻分析结果显示，EFA组相比CON组有5个传感器响应显著升高：W1C增加32.44%，W5C增加21.30%，W1S增加32.63%，W1W增加67.76%，W2S增加23.58%（p<0.05）。经Benjamini-Hochberg多重检验校正后这5个传感器仍保持显著，且效应量大（Cohen's d值分别为2.81、3.13、2.44、4.16和2.91）。PCA和OPLS-DA分析均显示两组间存在明显分离，表明粪肠球菌JM263补充显著改变了牦牛肉的整体香气相关响应特征。
4.2 两组牦牛肉挥发性代谢物的差异
GC-MS分析共推定注释了688个挥发性特征，其中677个为两组共有，11个为EFA组特有。以相对气味活度值（rOAV）>1为筛选标准，CON组检出42个候选气味相关挥发性特征，EFA组检出45个。OPLS-DA模型显示R2X=0.729，R2Y=0.992，Q2=0.651，200次置换检验支持模型稳健性。基于VIP>1、FC>1.5或<0.67、p<0.05的探索性标准，共筛选出24个候选差异挥发性代谢物，其中16个上调、8个下调。VIP值最高的特征包括2-丙炔-1-醇丙酸酯（VIP=2.06，下调）、1-环丙基-2-(3,4-二甲氧基苯基)乙醇（VIP=1.96，上调）和4-(1,5-二甲基-1,4-己二烯基)-1-甲基环己烯（VIP=1.89，上调）。香气描述符注释表明，癸酸乙酯、十五烷和γ-十二内酯与苹果、白兰地、蜡质、果香、香脂、花香和脂肪香气描述符相关，而4-(1,5-二甲基-1,4-己二烯基)-1-甲基环己烯和苯甲酸与蜡质、醛香、柑橘、香脂和微弱描述符相关。
4.3 两组牦牛肉脂质组学特征
LC-MS/MS半定量脂质组学分析显示，CV分布和PCA分析中QC样本紧密聚集，表明分析稳定性良好。脂质组学数据揭示了粪肠球菌JM263补充对牦牛肉脂质组成的影响，差异脂质被注释到KEGG通路进行富集分析，以探索脂质代谢变化与香气相关挥发性特征之间的潜在关联。
五、讨论与结论
本研究通过整合电子鼻、风味组学和脂质组学三种技术，系统表征了粪肠球菌JM263补充对牦牛肉香气相关特征的影响。电子鼻分析表明益生菌补充显著改变了牦牛肉的整体香气响应模式，风味组学揭示了与果香和脂肪香气描述符相关的挥发性代谢物变化，脂质组学则提供了脂质来源香气前体代谢变异的候选特征。多组学整合分析显示了探索性的基质水平关联。这些发现为理解益生菌调控牦牛肉风味形成的机制提供了新的视角，为益生菌在舍饲牦牛生产中的应用和优质高原肉制品开发奠定了理论和实践基础。研究结论指出，粪肠球菌JM263补充可调节牦牛肉香气相关挥发性特征和脂质来源香气前体代谢，相关脂质可作为香气相关代谢变异的候选特征，多组学分析显示了探索性的基质水平关联。
