基于碱性磷酸酶催化的Eu3+配位聚合物的比率荧光免疫分析法，用于检测赭曲霉毒素A

《Food Chemistry》：Ratiometric fluorescent immunoassay mediated by alkaline phosphatase-catalyzed Eu3+ coordination polymers for the detection of Ochratoxin A

　　

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  Eu-CP在室温下自组装，能够实现双荧光信号的反向调节。
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  OTA的检出限（LOD）低至0.0273 ng/mL（线性范围为0.4883–62.5 ng/mL），具有优异的灵敏度。
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  具有高特异性和良好的探针及批次间稳定性。
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  适用于合格粮样回收，适合现场初步筛查。

引言

赭曲霉毒素A（OTA）是由属于Aspergillus和Penicillium属的真菌产生的一种次级代谢产物。其分子结构中含有异香豆素和苯丙氨酸残基，使其具有极高的化学稳定性和热稳定性。传统的食品加工技术如煮沸（100°C）和烘烤（180°C）无法降解OTA（Ben Miri等人，2024年；Miao等人，2023年）。因此，OTA会在玉米、燕麦和大米等各种农产品和食品中积累（Casu等人，2024年；Hassan等人，2023年）。OTA通过食物链进入人体后，能够以10⁵到10⁶ L/mol的结合常数与血清白蛋白紧密结合。长期暴露于OTA可能导致肾小管损伤和肝实质病变。此外，OTA的二氢异香豆素环上的氯原子可诱导DNA链断裂（Xu等人，2022年）。基于这些原因，国际癌症研究机构将OTA归类为2B类致癌物（Wang等人，2024年；Wi?ckowska等人，2024年）。因此，开发高灵敏度的OTA检测技术是食品安全控制的重要步骤。

目前，OTA的检测策略主要分为仪器分析方法和免疫测定法（Fan等人，2023年；Liu等人，2024年）。仪器分析方法如高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）依赖于色谱分离和质谱鉴定（Zhao等人，2024年）。尽管这些方法的检测限较低，但需要昂贵的设备、复杂的样品预处理过程和专业操作人员，不适合现场筛查（Fan等人，2023年）。在免疫测定法中，间接竞争性酶联免疫吸附测定（ic-ELISA）由于其高特异性、低成本和高通量而被广泛用于OTA的常规检测（Zhao等人，2024年）。目前，新型ELISA和其他分析方法已实现了每毫升纳克甚至皮克级别的检测灵敏度（Maphaisa等人，2025年；Wang等人，2024年）。然而，这种高性能通常依赖于复杂的纳米材料信号放大系统、严格的反应条件或专用分析仪器。同时，ic-ELISA也存在摩尔消光系数低和易受样品基质干扰等局限性（Qin等人，2020年）。作为另一种广泛应用的免疫测定平台，侧向流动免疫测定（LFIA）因其快速、无需设备且适合现场筛查而备受青睐（Quesada-González & Merko?i，2015年）。然而，传统的LFIA主要是定性的或半定量的。由于检测区直接暴露在复杂的样品提取物中，LFIA的光学读数极易受到基质干扰（散射和背景色），使得微量目标的精确量化极具挑战性（Long等人，2025年）。

单响应比值荧光方法具有一定的优势，因为它们可以消除由微环境因素引起的干扰，并减少外部因素的影响。然而，这些方法无法提高检测灵敏度，无法满足检测低浓度目标的要求（Deng等人，2022年）。相比之下，双响应比值荧光分析具有更优越的检测性能。它利用双荧光信号的强度比作为检测信号，并具有信号自校准效果（Safaei等人，2025年；Zhang等人，2024年）。两种信号受温度和样品基质的影响方式一致，这使得比率能够抵消系统误差，从而显著减少背景干扰。其检测灵敏度通常比单响应比值荧光方法高1-2个数量级（Liu等人，2025年）。

尽管现有双响应比值荧光技术具有显著优势，但仍存在一些缺点。一些双响应比值荧光方法依赖于两种荧光材料的组合，这带来了制备过程复杂和荧光共振能量传递效率低的问题（Goshisht等人，2023年）。其他方法需要对荧光探针进行繁琐的化学修饰，导致成本高和稳定性差（Zhuang等人，2021年）。现有研究针对不同的分析目标构建了多种基于信号调节的检测系统。虽然大多数研究集中在单信号或双信号响应的基本设计上，但它们为双响应比值荧光方法的优化提供了重要参考（Wu等人，2023年）。同时，关于实际样品基质适应性的探索性研究也为解决现有方法的制备过程和稳定性控制等方面的局限性提供了实际见解（Miao等人，2024年）。

聚集诱导发射（AIE）材料克服了传统荧光材料的聚集引起的淬灭效应，具有优异的光稳定性和高信噪比。作为典型的稀土离子，Eu³⁺具有较大的斯托克斯位移和特征发射峰。然而，Eu³⁺的摩尔吸收系数较低，导致自敏化的发光效率相对较低（Tigaa等人，2017年）。为了解决这一问题，一些具有AIE特性的配体被引入系统中，通过与Eu³⁺的配位作用，通过天线效应（AE）有效传递能量（Zeng等人，2020年），从而有效解决了Eu³⁺的发光问题。

碱性磷酸酶（ALP）是免疫测定中常用的标记酶，可以催化磷酸单酯的水解。在我们之前的工作中（Zhao等人，2024年），我们建立了一种基于ALP催化的

-硝基苯基磷酸（PNPP）水解生成4-硝基苯酚的双响应比值荧光免疫测定方法。在此基础上，本研究通过在室温下自组装环丙沙星（CIP）、腺苷一磷酸（AMP）和Eu³⁺，制备了一种Eu³⁺配位聚合物（Eu-CP）。在这种配位聚合物中，CIP作为AIE配体，通过AE将能量传递给Eu³⁺，从而显著增强Eu³⁺的荧光并降低CIP本身的荧光。Eu-CP可以选择性地响应ALP。在反应过程中，Eu³⁺的荧光强度显著降低，而CIP的荧光逐渐恢复，从而实现了一种ALP催化的、Eu-CP介导的双响应比值荧光免疫测定方法用于OTA检测。通过这种方法制备的聚合物可以直接响应ALP，并同时提供两种不同的荧光变化。在提高检测灵敏度和准确性的同时，它简化了实验操作，为农产品中痕量OTA的分析提供了一种新的技术途径。

章节片段

试剂和仪器

牛血清白蛋白-OTA结合物（BSA-OTA）和OTA单克隆抗体（Ab1）购自Bio-Sky Biotechnology Co., Ltd.（中国大连）。IgG-ALP购自Biosynthesis Biotechnology Co., Ltd.（中国北京）。标准物质包括OTA、黄曲霉素B1（AFB1）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、伏马菌素B1（FB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和T-2毒素购自Pribolab Biotech Co., Ltd.（中国青岛）。CIP、AMP、Eu(NO?)?·6H?O和ALP粉末购自Macklin

基于双响应信号的比值荧光免疫测定的原理

建立了一种基于间接竞争免疫反应的Eu-CP介导的双响应比值荧光免疫测定方法用于OTA检测。Eu-CP由CIP、AMP和Eu³⁺自组装而成（图1A）。在这种配位聚合物中，CIP通过AE使Eu³⁺产生618 nm的红色荧光，同时抑制了Eu³⁺自身的418 nm蓝色荧光，从而形成了初始信号特征。

在检测过程中（图1B），使用BSA-OTA作为完全抗原涂覆96孔板

结论

本研究成功建立了一种ALP催化的Eu-CP介导的比值荧光免疫测定方法。基于AIE和AE，该方法实现了OTA的高灵敏度检测。该方法具有宽线性范围（0.4883–62.5 ng/mL）、低LOD（0.0273 ng/mL）、高特异性和稳定性。在实际样品（包括玉米、燕麦和大米）中的回收率符合AOAC标准。操作简单

CRediT作者贡献声明

郭海蓉：撰写 - 原稿、方法学、数据分析、概念化。 赵雅楠：方法学、数据分析、概念化。 季尚鸿：数据分析。 潘婷瑶：数据分析。 徐伟珍：数据分析。 周旭梅：数据分析。 周瑜：撰写 - 审核与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化。

伦理批准和参与同意

本研究不涉及动物实验、人体试验或感官评估实验，符合相关研究伦理指南。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本论文工作的利益冲突或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（NSFC，项目编号32272411）、四川省科技教育联合基金项目（项目编号2025NSFSC2020）和四川科技大学人才引进项目（2025RCZ0076, 2025RCZ046）的支持。

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