FSP1+基质细胞相关巨噬细胞胞葬作用促进子宫腺肌症蜕膜化障碍的机制研究

《Human Reproduction》：FSP1+ stromal cell-associated macrophage efferocytosis contributes to impaired decidualization in adenomyosis

　　

研究问题： 细胞间通讯紊乱是否导致子宫腺肌症胚胎着床失败？其分子机制是什么？ 概要回答： 子宫腺肌症中扩增的成纤维细胞特异性蛋白1（FSP1）阳性基质细胞可能通过GAS6相关巨噬细胞胞葬作用，促进巨噬细胞肿瘤坏死因子α（TNF-α）分泌及邻近基质细胞衰老。 已知信息： 子宫腺肌症损害子宫内膜容受性和蜕膜转化，导致着床失败和妊娠丢失。该病患者子宫内膜巨噬细胞数量增加。 研究设计、规模与周期： 研究人员对3例子宫腺肌症患者分泌中期在位内膜样本进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），并与公开的正常子宫内膜scRNA-seq数据（GSE183837）整合，以刻画细胞改变和细胞间互作。分离原代人子宫内膜基质细胞和子宫内膜巨噬细胞进行体外机制研究（包括基因操作和功能共培养实验以探究基质-巨噬细胞串扰）。通过M-CSF诱导外周血单个核细胞来源的巨噬细胞进一步验证胞葬相关机制，并采用机械损伤诱导的C57BL/6小鼠子宫腺肌症模型在体内验证关键分子变化。 参与者/材料、设置与方法： ScRNA-seq数据经Cell Ranger和Seurat进行聚类和差异表达分析，细胞间通讯通过CellPhoneDB和CellChat分析。巨噬细胞胞葬作用通过TUNEL/CD68染色和体外共培养实验评估。衰老通过衰老相关β-半乳糖苷酶染色及衰老标志物/衰老相关分泌表型（SASP）谱系评估，蜕膜化通过催乳素（PRL）和胰岛素样生长因子结合蛋白1（IGFBP1）的mRNA或蛋白水平评估。机制研究方法包括腺病毒转导、实时定量PCR、免疫印迹、酶联免疫吸附测定（ELISA）、染色质免疫沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）、免疫组织化学、免疫荧光和EdU染色。 主要结果与偶然性作用： 研究结果揭示，子宫腺肌症患者分泌中期在位内膜中FSP1+基质细胞丰度显著升高。这些FSP1+基质细胞通过转录因子ZBTB7A调控GAS6分泌，而GAS6可与巨噬细胞上的MERTK受体相互作用促进胞葬作用。值得注意的是，激活的巨噬细胞分泌TNF-α，导致基质细胞衰老并可能加剧蜕膜化缺陷，从而进一步损害生育力。 大规模数据： 原始scRNA-seq数据已存入NCBI序列数据库，登录号为PRJNA1270747。 局限性及注意事项： 将内部样本与公共数据整合以及相对较小的发现队列可能引入偏倚。GSE183837中的对照样本来自因男性因素不孕接受IVF的女性，可能不能完全代表未干预的生理性分泌中期子宫内膜。坦莫扎替尼（Tamnorzatinib）是一种AXL/MERTK双靶点抑制剂，因此胞葬效应不能单独归因于MERTK信号。需要在更大临床队列、基因敲除小鼠模型和人子宫内膜类器官中进行进一步研究以证实所提出的机制。 研究发现的更广泛意义： FSP1+基质细胞在巨噬细胞胞葬作用和蜕膜化缺陷中发挥关键作用。靶向GAS6-MERTK-TNF-α通路可能为治疗子宫腺肌症的蜕膜化障碍提供潜在治疗策略。 资助： 本研究受国家自然科学基金（No. 82401964, 82371678）、江苏省自然科学基金（No. BK20240224）及非传染性疾病-国家重点研发计划（No. 2023ZD0518400）资助。 利益冲突声明： 作者声明无利益冲突。 试验注册号： 不适用。

论文解读

研究背景与科学问题

子宫腺肌症是子宫内膜组织侵入子宫肌层导致的局部或弥漫性病变，显著损害子宫内膜容受性，阻碍胚胎成功着床。在复发性流产女性中，子宫腺肌症发病率高达约40%，但其导致胚胎着床失败的机制尚不清楚。成功的妊娠需要发育正常的胚胎和处于容受状态的子宫内膜。分泌期子宫内膜上皮细胞进入“容受状态”准备启动母胎对话，同时基质细胞的蜕膜化过程被激活——这是子宫内膜向容受态转化的关键标志，也是胚胎进一步侵入子宫内膜并继续发育的前提。蜕膜化是指子宫内膜基质细胞（endometrial stromal cells, ESCs）经历细胞骨架重塑，从初始的成纤维细胞样转化为特化的蜕膜分泌细胞。蜕膜化不足与胚胎着床失败、复发性自然流产等妊娠并发症密切相关。巨噬细胞是参与子宫内膜周期性脱落后修复和再生的关键细胞，占子宫内膜细胞的10%。多项研究报道子宫腺肌症患者子宫内膜中巨噬细胞数量增加，且与疾病严重程度密切相关。然而，巨噬细胞-基质细胞串扰在介导子宫腺肌症蜕膜化缺陷中的作用仍不明确。基于此，本研究旨在探索子宫腺肌症中细胞间通讯紊乱对着床失败的影响及其分子机制。

研究内容与主要结论

研究人员通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合生物信息学分析、体外细胞共培养实验和动物模型，揭示了子宫腺肌症中FSP1⁺基质细胞亚群扩增，并通过GAS6-MERTK信号轴促进巨噬细胞胞葬作用（efferocytosis，即吞噬细胞吞噬凋亡细胞的过程），进而诱导邻近基质细胞衰老和蜕膜化缺陷的分子机制。主要结论如下：①子宫腺肌症患者分泌中期在位内膜中FSP1⁺基质细胞比例显著升高；②FSP1⁺基质细胞通过转录因子ZBTB7A调控GAS6分泌，GAS6与巨噬细胞表面MERTK受体结合促进胞葬作用；③增强的巨噬细胞胞葬作用导致TNF-α分泌增加，诱导FSP1^-基质细胞衰老，最终损害蜕膜化过程。这一发现为改善子宫腺肌症患者蜕膜化和提高妊娠成功率提供了潜在分子治疗靶点。

关键技术方法

研究人员采用了多种关键技术方法：①对3例子宫腺肌症患者分泌中期在位内膜样本进行scRNA-seq，并与公开数据库（GSE183837，包含3例正常对照）中的正常子宫内膜scRNA-seq数据整合分析；②利用CellPhoneDB和CellChat进行细胞间通讯分析；③采用SCENIC（单细胞调控网络推理和聚类）分析转录因子调控网络；④通过原代细胞分离和共培养体系（分离自人子宫内膜的基质细胞和巨噬细胞）进行体外功能研究；⑤利用M-CSF诱导外周血单个核细胞（PBMCs）分化为巨噬细胞用于验证胞葬机制；⑥建立机械损伤诱导的C57BL/6小鼠子宫腺肌症模型进行体内验证。

研究结果

一、子宫腺肌症在位内膜中FSP1⁺基质细胞比例升高

通过对scRNA-seq数据的降维聚类和注释，研究人员鉴定出七种主要细胞类型。基质细胞进一步分为五个亚群：功能性细胞、FSP1⁺细胞、间充质-上皮转化细胞、增殖细胞和祖细胞。定量分析显示，子宫腺肌症患者功能性细胞比例降低，而FSP1⁺细胞比例显著升高。免疫荧光染色证实FSP1与基质细胞标志物WT1共定位，确认FSP1⁺基质细胞比例增加。

二、FSP1⁺基质细胞调节巨噬细胞胞葬作用

细胞间互作分析表明，FSP1⁺基质细胞与巨噬细胞间的配体-受体（ligand-receptor, L-R）对最为丰富。其中GAS6-MERTK L-R对在子宫腺肌症组中显著激活。GAS6由基质细胞分泌，作用于巨噬细胞的MERTK受体，提示巨噬细胞胞葬作用的发生。FSP1⁺基质细胞中凋亡标志物CASP3表达升高，为胞葬提供了前提条件。MERTK仅在巨噬细胞上特异性表达且在子宫腺肌症中上调。TUNEL/CD68共染和体外胞葬实验证实子宫腺肌症患者子宫内膜中巨噬细胞胞葬作用增强，伴随TGF-β1和PGE2等促消退因子分泌增加。

三、GAS6-MERTK是关键L-R对

通过构建FSP1小干扰RNA（siFSP1）和过表达质粒（FSP1-OE）处理ESCs，研究人员发现FSP1过表达可上调GAS6和CASP3表达，增强巨噬细胞MERTK表达和胞葬能力。使用GAS6中和抗体（Anti-GAS6）或AXL/MERTK双靶点抑制剂坦莫扎替尼（Tamnorzatinib）可逆转这些效应，证实GAS6-MERTK信号轴的关键作用。

四、FSP1⁺基质细胞分泌GAS6的机制

SCENIC分析鉴定出四个靶向GAS6的转录因子：CHD2、ZBTB7A、ATF3和NR3C1。其中ZBTB7A在子宫腺肌症中活性最高、细胞可及性最强，且在GAS6⁺细胞中表达显著上调。功能实验表明，FSP1过表达上调ZBTB7A，而沉默ZBTB7A可抑制GAS6表达。染色质免疫沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）证实ZBTB7A可直接结合GAS6启动子区域。

五、巨噬细胞胞葬诱导基质细胞衰老和蜕膜化缺陷

对FSP1^-基质细胞的差异表达基因进行KEGG富集分析，发现“细胞衰老”通路显著富集。体外实验显示，与经胞葬的巨噬细胞共培养后，FSP1^-基质细胞衰老标志物（SA-β-gal阳性率、p21、p16）升高，增殖能力下降，蜕膜化标志物PRL和IGFBP1表达降低。TNF-α中和抗体可部分逆转这些效应。在小鼠模型中，子宫腺肌症组胚胎着床数和活胎数减少，而坦莫扎替尼处理可改善蜕膜化和生育结局。

讨论与结论总结

本研究发现FSP1⁺基质细胞在子宫腺肌症患者分泌中期在位内膜中显著扩增，这些细胞通过转录因子ZBTB7A上调GAS6分泌，GAS6与巨噬细胞表面MERTK受体结合促进胞葬作用。增强的胞葬作用导致巨噬细胞TNF-α分泌增加，进而诱导FSP1^-基质细胞衰老，最终损害蜕膜化过程。靶向GAS6-MERTK-TNF-α通路可能为治疗子宫腺肌症相关的蜕膜化障碍提供新的治疗策略。