《Food Hydrocolloids》：Characterizing freeze-thaw instability in pectin-stabilized dairy gels using STED and FLIM microscopy
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•STED和FLIM显微成像技术表征了果胶稳定乳制品凝胶的冻融响应。•STED揭示了富含蛋白质的网络中冻融相关的结构重组现象。•FLIM分辨了蛋白质区域、界面区域和孔隙区域中的探针敏感环境差异。•HMP和LMP表现出不同的结构性和宏观冻融响应。•冻融后，水分分离增加，而Hel
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STED和FLIM显微成像技术表征了果胶稳定乳制品凝胶的冻融响应。
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STED揭示了富含蛋白质的网络中冻融相关的结构重组现象。
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FLIM分辨了蛋白质区域、界面区域和孔隙区域中的探针敏感环境差异。
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HMP和LMP表现出不同的结构性和宏观冻融响应。
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冻融后，水分分离增加，而Helipath表观黏度降低。
引言
酸化乳制品凝胶（包括酸奶和果胶稳定乳制品体系）在加工和储存过程中容易发生不稳定现象。配方或热历史的改变可能促进相分离、脱水收缩和质地劣化（Arab等人，2023；Lucey等人，1998）。冻融（FT）胁迫尤其具有破坏性，因为冰晶形成会浓缩蛋白质、多糖、盐类及其他非冻结组分于未冻结相中，同时重新分配水分并机械扰动凝胶网络。解冻后，这些变化可能表现为水分分布改变、脱水收缩增加和结构异质性（Chen等人，2024；Cui等人，2022；Feng等人，2023；Liu等人，2023；Zhao等人，2022；Zhu等人，2025）。蛋白质及蛋白质-多糖凝胶的研究也类似地将FT暴露与网络形态、持水性能和宏观稳定性的变化联系起来（X. Li等人，2024；Qin等人，2022）。反复的FT循环可通过增加孔隙率和结构破坏来加剧这些效应（Duggal等人，2026）。因此，在结构和功能尺度上表征这些变化对于理解配方如何影响凝胶在热胁迫下的稳定性具有重要意义。
传统整体测量方法（如流变学和脱水收缩测定）虽能提供乳制品凝胶功能状态的宝贵信息，但无法直接分辨底层的微观结构组织。经典光学和共聚焦显微镜在分辨衍射极限以下的结构特征方面也存在局限性（Lucey等人，1998；Skytte等人，2015）。酪蛋白胶束和小蛋白质聚集体出现在从数十纳米到数百纳米的长度尺度上，接近或低于常规共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）约200纳米的横向分辨率（De Kruif等人，2012；Lucey等人，1998；Skytte等人，2015）。超分辨率方法，如受激发射耗尽（STED）显微镜，可克服这一局限，在合适的成像条件下达到30-50纳米量级的横向分辨率（Bonilla & Clausen，2022；Hell & Wichmann，1994）。因此，STED已被用于可视化和定量表征食品蛋白质及乳制品凝胶体系中的纳米尺度组织（Foroutanparsa等人，2023；Glover, Bisgaard等人，2019；Glover, Ersch等人，2019；R. Li等人，2023；Mishra等人，2025）。由于水分保持、质地和机械稳定性等宏观特性源于凝胶网络的组织，定量显微成像可提供与传统整体测量互补的结构信息（Le Ba等人，2025；Lucey，2001）。
本研究扩展了我们近期建立的用于酸化乳制品凝胶的STED和荧光寿命成像显微镜（FLIM）联合框架（Mishra等人，2025）。在该工作中，将高甲氧基和低甲氧基果胶引入酸化脱脂乳凝胶模型中，并使用超分辨率成像和荧光寿命映射表征了结构组织和局部探针敏感环境。FLIM方法使用黏度敏感的分子转子探针（Chambers等人，2018；Kuimova等人，2008），其荧光寿命取决于分子内旋转在多大程度上受周围物理化学环境的限制。在不均匀食品凝胶中，此类探针可提供局部分子约束的空间分辨信息，尽管寿命响应也可能取决于黏度以外的因素（Glover等人，2020）。
我们先前的研究表明，STED结合自相关分析可以定量表征乳制品凝胶结构中取决于配方的差异，而FLIM可以分辨分子转子探针所经历局部环境的空间差异（Mishra等人，2025）。在建立静态条件下的框架之后，本研究考察了其对施加的破坏性胁迫的响应。含有HMP或LMP的酸化脱脂乳凝胶以及未加稳定剂的参照配方被置于受控的单次冻融循环中，并在解冻后进行表征。冻融处理被用作一种受控加速扰动以诱发可测量的不稳定化，而非复现特定的商业冷链历史。选择单次冻融循环是为了考察对最小施加冻结事件的响应，同时避免与反复循环相关的更广泛损伤。由于冻结温度、冷却速率、样品几何形状和FT循环次数均影响冰晶形成和凝胶损伤，在未进行进一步验证的情况下，研究结果不应直接外推至商业冻结或反复温度循环。
因此，我们使用互补的显微成像和宏观测量方法来评估冻融相关的变化。STED自相关分析用于定量表征ACF衍生结构重复距离和短程关联长度，而FLIM用于表征富含蛋白质区域、界面区域和孔隙相关区域内的局部探针敏感环境。宏观水分分离和Helipath表观黏度提供了解冻后凝胶稳定性的独立功能性读数。由于显微成像和整体实验涉及不同的样品几何形状及冷却和解冻动力学，它们被视为互补的测量而非直接等效的跨尺度测量。据我们所知，将STED和FLIM联合应用于冻融诱导的乳制品凝胶不稳定化此前尚未有报道。因此，本研究将我们已建立的显微成像框架从静态配方比较扩展到对受控冻融胁迫后结构性和探针敏感响应的表征。
各章节摘要
材料
脱脂乳（Christianfeld M213）购自Arla Foods a.m.b.a.（丹麦奥胡斯Viby）。两种商业柑橘来源的果胶，GRINDSTED?果胶SY 200和GRINDSTED?果胶AMD 783，由International N&H Denmark ApS/IFF（丹麦Brabrand）提供。根据供应商规格，SY 200用作LMP配方，是一种低酯化、低钙反应性果胶，经糖类标准化，典型酯化度为47%，1%溶液的pH为3.4-4.0。
STED表征对照凝胶和冻融处理凝胶
首先使用STED显微镜检查凝胶微观结构中配方和处理相关的差异。为简洁起见，ASMG指代未添加果胶的酸化脱脂乳凝胶，而HMP和LMP分别指代含有高甲氧基和低甲氧基果胶的相应ASMG配方。
图1展示了三种配方在冻融处理前后的代表性STED图像。未处理对照组（图1. A-C）表现出取决于配方的差异
讨论
本研究表明，单次冻融（FT）处理在酸化脱脂乳凝胶中产生可测量的结构和宏观变化，而FLIM提供了关于局部探针敏感微环境的互补描述性信息。不同测量方法捕获了解冻后状态的不同方面。STED通过ACF衍生结构长度尺度表征蛋白质网络组织的变化，FLIM报告分子转子探针所经历的局部光物理环境
结论
单次冻融（FT）处理在酸化脱脂乳凝胶中产生可测量的结构和宏观变化，而STED、FLIM、水分排出和Helipath测量提供了关于解冻后响应的互补信息。在所采样显微制备样品中，STED自相关分析显示冻融后HMP和LMP中λ更高，三种配方中ξ均更高，与特征结构长度尺度的重组一致。FLIM一致地
作者贡献声明（CRediT）
Adam Cohen Simonsen：撰写——审阅与编辑、验证、指导、项目管理、资金获取、形式化分析、概念构思。Flemming M?ller：撰写——审阅与编辑。Ulf Andersen：撰写——审阅与编辑。Jonathan R. Brewer：撰写——审阅与编辑、指导。Matias Via：撰写——审阅与编辑。Vinay S.N. Mishra：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、软件、资源、方法论、调查、形式化
利益冲突声明
本手稿未在别处发表，也未正在另一期刊审稿中。所有作者均已批准本手稿并同意将其提交给《食品流变学》（Food Hydrocolloids）。所有作者均已阅读并接受《食品流变学》出版道德准则。最后，作者声明无任何已知的利益冲突。
利益冲突声明
? 作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所报告工作的客观性。
致谢
作者感谢丹麦乳制品研究基金会（DDRF）、Arla Foods和IFF对本项目"混合乳制品增强稳定性的显微成像技术（MicroTool）"的经费支持。我们同样感谢Trine N?rgaard Bundesen博士、Henrik Damsgaard Lovmand先生和Liselotte Kimose女士（International Flavors and Fragrances，奥胡斯）提供的技术指导；Frederik W. Lund博士和Morten F. Ebbesen博士提供的技术支持；以及Sean Hogan博士、Aayushi Mishra女士和
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