《Food Microbiology》：Cold-induced transcriptomic responses are associated with strain-dependent
Salmonella enterica persistence in refrigerated lettuce leaves
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摘要肠炎沙门氏菌是引发绿叶蔬菜相关食源性暴发疫情的主要原因之一。冷藏储存是保障绿叶蔬菜安全的重要基石，然而在不同冷藏条件下，内生肠炎沙门氏菌在不同菌株间持续存活能力差异的研究仍十分有限。对十一株肠炎沙门氏菌菌株进行筛查发现，它们在10 °C条件下脱离的生菜叶片内部的持续存活能
摘要
肠炎沙门氏菌是引发绿叶蔬菜相关食源性暴发疫情的主要原因之一。冷藏储存是保障绿叶蔬菜安全的重要基石，然而在不同冷藏条件下，内生肠炎沙门氏菌在不同菌株间持续存活能力差异的研究仍十分有限。对十一株肠炎沙门氏菌菌株进行筛查发现，它们在10 °C条件下脱离的生菜叶片内部的持续存活能力存在显著差异。选取了两株表现出截然不同持续存活表型的分离株进行详细分析，分别属于蒙得维的亚群和纽波特亚群，这些差异在4 °C条件下得到确认。为探究与这种差异相关的转录反应，我们利用RNA测序对营养丰富培养基中冷应激的转录组反应进行了表征，并评估了冷暴露后的恢复情况。两株分离株在28 °C下生长速度相近，但在4 °C下出现分化，其中蒙得维的亚群菌株维持了更高的生长能力。KEGG通路和基因本体术语的功能富集分析显示，两者共享的抑制反应涉及中心代谢和能量生成通路，同时诱发了应激反应过程。在冷暴露后，与一般应激反应、冷休克功能以及包膜完整性相关的基因在蒙得维的亚群菌株的诱导反应中更为突出。这些结果表明，冷藏生菜储存期间沙门氏菌持续存活能力的菌株依赖性差异与培养细菌中观察到的对冷应激及冷后恢复的不同转录反应相关。考虑菌株水平的变异可能有助于改善对绿叶蔬菜储存期间病原体持续存活的解读，并为未来的微生物风险评估提供参考。
引言
由肠炎沙门氏菌引发的食源性疾病暴发仍然是全球面临的重大公共卫生挑战（世界卫生组织，2021）。绿叶蔬菜，尤其是生菜，常被视为沙门氏菌和致病性大肠杆菌等人畜共患病原体的传播载体（Barril等人，2022；Yang和Scharff，2024；Zhao等人，2025）。新鲜农产品可能通过多种途径受到污染，包括农业因素如灌溉水、土壤改良剂和野生动物活动，以及采后作业中的交叉污染和人为操作（Allende等人，2025；Thomas等人，2024）。
细菌在叶球界的持续存活取决于遗传、代谢和结构特征的综合作用，这些因素与植物宿主、本地微生物群及环境条件相互影响（Holden和Barak，2025）。沙门氏菌适应叶片表面和叶片内部组织中异质性微环境的能力可能有助于其在采后储存期间持续存活，并增加消费者暴露风险（Kroupitski等人，2013；Grivokostopoulos等人，2022；Faria等人，2025）。尤其值得关注的是叶面质外体，内化的细菌细胞在此可能部分免受表面卫生处理的影响（Niemira和Cooke，2010；Tudela等人，2019）。沙门氏菌可通过气孔进入叶片内部组织，这一过程受细菌活性、植物基因型、温度和相对湿度的影响（Roy和Melotto，2019；Grivokostopoulos等人，2022；Fochs等人，2025）。一旦内化，细菌的存活还受质外体化学组成及植物免疫反应的影响，包括活性氧和抗菌化合物的积累（George等人，2024；Hudson和Micallef，2026）。
采后环境条件可进一步改变与绿叶蔬菜相关的沙门氏菌存活率和生理状态。洗涤过程中接触氧化性消毒剂可在沙门氏菌中引发广泛的转录反应（Dunn等人，2020；Wang等人，2022），这可能影响其后续对环境应激的反应。在干旱或酸应激下进行预处理也被证明可在5 °C条件下储存芝麻菜、苦苣、生菜和菠菜时增加内生沙门氏菌种群数量（Grivokostopoulos等人，2022a，2022b）。同样，沙门氏菌的预生长温度可影响其在脱离生菜叶片上的附着、内化和持续存活（Kroupitski等人，2019；Kaur等人，2023）。采后储存可能引入额外的环境变化，例如通过气调包装技术升高CO2和降低O2浓度（Oliveira等人，2015）。这些改变后的大气环境不仅影响沙门氏菌（Horev等人，2012）和E. coli O157:H7等人畜共患病原体的持续存活，还影响它们与植物组织腐坏及本地微生物群落的相互作用（Leonard等人，2021）。此外，冷藏仍然是限制微生物腐败和保持新鲜农产品品质的关键因素，因为它直接影响微生物和采收植物器官的代谢与生理过程（Palou和Smilanick，2020；Dodd等人，2022）。
肠炎沙门氏菌在约10至45 °C的温度范围内繁殖，最适生长温度接近35–37 °C（Bronikowski等人，2001；Velugoti等人，2011）。常规冷藏温度约0–5 °C通常可阻止新鲜农产品上微生物种群的净增长（Delbeke等人，2015；Tarlak等人，2020；Alves等人，2024；Faria等人，2025）。然而，存活和消亡动态受植物基因型（Alegbeleye和Sant'Ana，2022）、温度波动和滥用（Zeng等人，2014）以及商品类型（例如，整果与鲜切产品；Krof等人，2022）等因素的显著调节。在细胞水平上，冷暴露会引发广泛的生理重塑，包括转录和翻译变化、膜组成改变、DNA拓扑结构改变、冷休克蛋白产生、调控网络以及跨膜转运变化（Zhu等人，2017；Ricke等人，2018；Virtanen等人，2018；Duru等人，2021）。冷应激反应在大肠杆菌中已广泛通过转录组学研究，涵盖最小培养基（Jozefczuk等人，2010；Ying等人，2015）和营养丰富培养基（Hücker等人，2017；Li等人，2018）。近期，RNA测序分析揭示了肠杆菌科细菌在营养丰富培养基中冷适应的基因型变异（Hoang等人，2024）以及生菜冷藏储存期间不同E. coli O157:H7分离株的差异（Ding等人，2025）。然而，肠炎沙门氏菌菌株水平的冷反应变异与冷藏绿叶蔬菜组织中持续存活能力之间的关联程度仍知之甚少。
在本研究中，我们考察了沙门氏菌菌株间遗传多样性如何影响其在冷藏储存期间在生菜叶片中的持续存活能力。通过将植物体内种群动态与培养细菌的转录组分析相结合，我们鉴定出与低温下增强持续存活能力相关的菌株特异性基因表达特征。这些发现增进了我们对沙门氏菌冷适应机制的理解，并突出了种内变异在决定采后绿叶蔬菜病原体污染风险中的重要作用。
章节片段
细菌菌株及接种物制备
本研究使用了一组十一株代表不同亚群的肠炎沙门氏菌分离株（表1）。这些菌株此前从智利用于农业灌溉的地表水中分离获得，提供了一个具有公开可用基因组序列的环境分离株多样集合（Toro等人，2022；Chen等人，2024）。将保存于?80 °C的甘油菌种划线接种于Luria-Bertani（LB）琼脂平板（Difco，美国密歇根州底特律），并在28 °C下
冷藏生菜中沙门氏菌持续存活能力在分离株间存在差异
为评估沙门氏菌在冷藏条件下生菜质外体中的持续存活能力，我们在10 °C条件下对十一株菌株进行了初步筛查（图1A）。各分离株在10天后的细菌净生长主要为负值，表明种群数量下降而非持续增殖。值得注意的是，分离株间的存活能力差异显著（p < 0.0001），净生长范围从SMv菌株的-0.02 ± 0.22到SNe菌株的-2.88 ± 0.27。基于
讨论
冷藏储存对于维持新鲜农产品的感官和营养品质以及限制采后处理过程中的微生物增殖至关重要（Thompson等人，2002；FAO/WHO，2017）。然而，与绿叶蔬菜相关的细菌种群在低温条件下持续存活能力差异显著。嗜冷乳酸菌，包括明串珠菌和鱼乳杆菌，经常占主导腐坏微生物群落
结论
本研究证明肠炎沙门氏菌菌株在冷藏储存期间于生菜中持续存活能力存在差异，反映了不同的、依赖于菌株的冷适应策略。通过将植物体内种群动态与培养细菌的转录组分析相结合，我们表明冷藏条件下增强的持续存活能力与冷暴露期间更多与应激反应通路相关的诱导基因有关。重要的是，这些菌株特异性
CRediT作者贡献声明
Nicolás González：方法论、调查研究。María Paz Araya：方法论、调查研究。Andrea I. Moreno-Switt：撰写——审阅与编辑、资源、概念化。Maeli Melotto：撰写——审阅与编辑、监督、概念化。Yohaily Rodríguez-Alvarez：撰写——原稿、可视化、方法论、调查研究、形式分析。Cristian Jacob：撰写——审阅与编辑、撰写——原稿、可视化、监督、资源、项目管理，
未引用参考文献
Callahan和Micallef，2019；Dodd和Bouwer，2022；Hoang和Stoebel，2024；Kaur和Yemmireddy，2023；Langmead和Salzberg，2012；Pradhan和Devi Negi，2019；Sant'Ana等人，2012；世界卫生组织，2021。
数据可用性
原始测序数据可在美国国家生物技术信息中心短读序列档案中获取，BioProject登录代码为PRJNA1368685。本研究中生成或分析的所有其他数据均包含在本文献及其补充信息文件中。
资金支持
本研究由智利国家研究与发展局（ANID）的基础研究启动基金资助，项目编号11231064，资助人为CJ。
利益冲突声明
? 作者声明不存在已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文献中报告的工作。
致谢
作者感谢Vivian Riveros和Javiera Cardoza提供的技术支持。
Yohaily Rodríguez-Alvarez|Nicolás González|María Paz Araya|Andrea I. Moreno-Switt|Maeli Melotto|Cristian Jacob
智利天主教大学农业与自然系统学院植物科学系，圣地亚哥，智利
