《IBRO Neuroscience Reports》：High-dose caffeine reduces neurite branching and alters expression of selected genes in immature primary rat cortical and hippocampal cell cultures
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高浓度咖啡因的消费在青少年和年轻成年人中日益增加。咖啡因是一种中枢神经系统兴奋剂，作为腺苷受体的非选择性拮抗剂发挥作用。腺苷受体信号传导参与大脑中的多种过程，但其在咖啡因诱导的发育中神经元细胞效应中所扮演的角色尚不清楚。本研究探讨了咖啡因、选择性腺苷A2A受体
高浓度咖啡因的消费在青少年和年轻成年人中日益增加。咖啡因是一种中枢神经系统兴奋剂，作为腺苷受体的非选择性拮抗剂发挥作用。腺苷受体信号传导参与大脑中的多种过程，但其在咖啡因诱导的发育中神经元细胞效应中所扮演的角色尚不清楚。本研究探讨了咖啡因、选择性腺苷A2A受体拮抗剂伊曲茶碱（istradefylline）及腺苷A2A受体激动剂CGS21680对未成熟大鼠原代皮层和海马细胞培养物的细胞活力、神经突生长、分支及mRNA表达的影响。咖啡因显著减少了海马和皮层细胞中的分支数、节点数和末端点数，且该效应在海马细胞中似乎更为显著。此外，高浓度咖啡因降低了海马和皮层细胞的神经突长度和线粒体功能，并降低了皮层细胞中单胺氧化酶B（MAO-B）和色氨酸羟化酶2的表达。伊曲茶碱也减少了海马细胞的神经突分支和生长，尽管这些效应不如咖啡因观察到的效应显著。这些研究结果表明，咖啡因减少神经元分支，且高浓度咖啡因还减少神经突长度和线粒体活性，并影响发育中神经元细胞中参与单胺能信号传导和神经元功能的基因。这些发现可能有助于理解大脑发育期间高咖啡因暴露的细胞学后果。
高剂量咖啡因对发育期神经元形态与基因表达的细胞学影响——基于原代皮层和海马细胞培养的研究解读
一、研究背景与问题
咖啡因作为全球消费最广泛的中枢神经系统兴奋剂，主要通过咖啡、茶及近年来流行的能量饮料被摄入。能量饮料在青少年和年轻成年人中的消费量持续上升，引发了对其潜在健康风险的关注。已有研究表明，能量饮料消费与心血管疾病风险增加、睡眠质量下降、心理困扰及恐慌行为相关。欧洲食品安全局（EFSA）建议成年人每日咖啡因摄入上限为400 mg，而青少年则为每日每公斤体重3 mg。然而，实际消费模式显示部分青少年群体可能通过能量饮料达到较高摄入水平。
咖啡因是非选择性腺苷受体拮抗剂，对腺苷A1受体（A1R）和A2A受体（A2AR）亚型具有最高亲和力。腺苷受体为G蛋白偶联受体，A1R抑制而A2AR刺激腺苷酸环化酶。A2AR信号通路参与神经元存活和生长，并调节脑源性神经营养因子（BDNF）的表达。选择性A2AR拮抗剂伊曲茶碱已被美国FDA批准作为帕金森病中左旋多巴的辅助治疗。此外，咖啡因对单胺氧化酶A（MAO-A）和单胺氧化酶B（MAO-B）具有拮抗作用，且对MAO-B的亲和力更高。血清素在情绪和焦虑障碍的病理生理中发挥核心作用，这可能解释咖啡因与焦虑的关联。
在细胞水平上，咖啡因对神经元发育、形态和活力的影响已有部分研究，但结果存在模型差异且机制尚不清楚。例如，0.3 mg/mL咖啡因处理可减少少突胶质细胞分化和海马神经元树突数量；而30 μM咖啡因在注意缺陷多动障碍模型中却促进神经元分化和恢复神经突生长；在人源神经元中，40–60 μM咖啡因抑制运动神经元而非皮层神经元的神经突生长。这些矛盾结果提示咖啡因的效应具有浓度依赖性和细胞类型特异性。因此，阐明咖啡因如何影响神经元形态，特别是神经突生长和分支，并识别参与该响应的基因，对于理解持续或高剂量咖啡因暴露对大脑的影响至关重要。
二、研究目的
本研究旨在探讨腺苷受体拮抗剂咖啡因和伊曲茶碱以及腺苷受体激动剂CGS21680在未成熟大鼠皮层和海马细胞培养物中的效应。评估的指标包括细胞活力、神经突发育以及参与多巴胺和血清素信号通路、脑源性神经营养因子（Bdnf）和β-III-微管蛋白（Tubb3）的选定基因的mRNA表达。
三、主要技术方法
研究人员从妊娠第17天的Sprague–Dawley孕鼠（n=8）中分离皮层和海马组织，建立原代细胞培养体系。细胞在体外培养1至3天期间每日接受一次药物处理，咖啡因浓度范围为3×10–6 M至1×10–3 M，伊曲茶碱和CGS21680浓度为3×10–6 M和1×10–5 M。研究采用免疫细胞化学结合高内涵成像系统进行神经突形态分析，使用ImageJ软件的自研宏程序量化神经突长度、分支数、节点数、末端点数及网络数等参数。MTT法用于评估线粒体活性，乳酸脱氢酶（LDH）释放实验用于评估细胞膜完整性。基因表达分析采用定量聚合酶链反应（qPCR），检测Drd2、Bdnf、Maoa、Maob、Tph2、Tubb3、Slc6a4、Htr1a和Htr2a共9个基因的mRNA水平，以Actb、Rpl19和Rplp0作为参考基因。统计分析采用单因素和双因素方差分析（ANOVA）结合Dunnett多重比较检验。
四、研究结果
4.1 非选择性腺苷拮抗剂咖啡因降低海马细胞神经突长度
在海马细胞中，咖啡因在三个最高浓度（1×10–4 M、3×10–4 M和1×10–3 M）下显著降低神经突长度。最高浓度1×10–3 M还减少了海马培养物中非神经元细胞的数量。在皮层细胞中，仅最高浓度1×10–3 M咖啡因显著降低了每个DAPI染色核的神经突长度和神经元数量。伊曲茶碱在最低浓度3×10–6 M下显著降低了海马细胞的平均神经突强度；CGS21680在海马细胞中未产生显著效应。在皮层细胞中，伊曲茶碱和CGS21680的两种浓度均显著降低了平均神经突强度。
4.2 腺苷受体调节降低神经元分支
在海马细胞中，最高浓度1×10–3 M咖啡因显著减少了分支数、节点数、总分支长度和网络数，三个最高浓度均显著减少了末端点数，而最高浓度增加了平均分支长度。在皮层细胞中，咖啡因显著减少了分支数、节点数和末端点数，其中两个最高浓度对分支数和节点数的减少效应显著；末端点数在1×10–5 M、1×10–4 M、3×10–4 M和1×10–3 M浓度下均显著减少。最高浓度增加了皮层细胞的平均分支长度，三个较低浓度（3×10–6 M、3×10–5 M和1×10–4 M）增加了网络数，多个浓度降低了总分支长度。伊曲茶碱在海马细胞中未产生显著效应，但在皮层细胞中，最高浓度1×10–5 M显著减少了末端点数，3×10–6 M增加了网络数。CGS21680在海马细胞中，最高浓度1×10–5 M显著减少了分支数、总分支长度和节点数；在皮层细胞中未观察到显著效应。
4.3 高浓度咖啡因降低线粒体功能
最高浓度1×10–3 M咖啡因在海马和皮层细胞中均显著降低了线粒体活性。伊曲茶碱和CGS21680对线粒体活性无显著影响。所有测试物质均未显著影响细胞膜完整性。
4.4 咖啡因改变皮层和海马细胞中单胺能和神经营养性mRNA表达
在皮层细胞中，咖啡因在最高浓度1×10–3 M下显著降低了MAO-B的mRNA表达；Tph2表达在1×10–5 M、3×10–4 M和1×10–3 M浓度下均显著降低。多巴胺D2受体表达在双因素ANOVA中显示显著处理效应，但事后检验未检测到显著差异。在海马细胞中，最高浓度1×10–3 M咖啡因显著增加了Htr2a和Bdnf的mRNA表达。
五、讨论与结论
研究结果表明，咖啡因对未成熟海马和皮层细胞的神经突生长、分支和线粒体活性具有剂量依赖性效应。多个咖啡因浓度减少了分支和总分支长度，而只有最高浓度显著影响神经突生长。选择性A2AR拮抗剂伊曲茶碱和激动剂CGS21680的效应有限，提示咖啡因的细胞效应可能涉及A2AR拮抗之外的其他机制。平均分支长度的增加可归因于节点数的减少，因为分支是从一个节点测量到下一个节点，节点形成减少导致整体分支长度增加，这实际上表明细胞生长在减缓。MAO-B和Tph2 mRNA表达的下调提示腺苷受体参与其他信号通路，这两种酶参与血清素和多巴胺的合成与代谢。咖啡因对MAO-B表达的抑制效应与既往报道的咖啡因对MAO-B的拮抗作用一致。伊曲茶碱未表现出类似效应，表明咖啡因诱导的mRNA下调不涉及A2AR拮抗。海马细胞中Htr2a和Bdnf的上调可能与咖啡因的非选择性腺苷受体拮抗特性有关，A1R可能也参与了咖啡因诱导的基因表达调控。
研究结论指出，咖啡因减少了未成熟原代海马和皮层细胞的分支数、节点数和末端点数，并降低了神经突长度。高浓度咖啡因对海马细胞的神经突生长以及皮层和海马细胞的线粒体活性产生负面影响。咖啡因还改变了参与单胺能信号传导和神经元功能的选定基因的表达。此外，研究结果提示咖啡因诱导的细胞效应可能涉及A2AR调节之外的机制。虽然这些发现不能直接外推至体内咖啡因消费，但有助于更好地理解高剂量或反复咖啡因暴露在细胞水平上可能如何影响神经元发育。
