《Current Proteomics》：An exploratory study in potential biomarkers discovery for LNM risk assessment in Chinese patients with esophageal squamous cell carcinoma at pT1a (mucosal) stage
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背景：食管癌（EC）是全球主要的恶性肿瘤之一，中国占全球病例的40%以上。食管鳞状细胞癌（ESCC）作为主要亚型，长期生存率仍然较差。内镜切除术已成为管理pT1a（黏膜层）ESCC的一种有价值的微创策略。然而，淋巴结转移（LNM）作为治疗方案选择的关键决定因素
背景：食管癌（EC）是全球主要的恶性肿瘤之一，中国占全球病例的40%以上。食管鳞状细胞癌（ESCC）作为主要亚型，长期生存率仍然较差。内镜切除术已成为管理pT1a（黏膜层）ESCC的一种有价值的微创策略。然而，淋巴结转移（LNM）作为治疗方案选择的关键决定因素，其准确评估仍具挑战性，因为当前临床影像技术对微转移性淋巴结病变的检测敏感性有限。因此，目前尚无可靠的共识标准。鉴于样本量有限（n = 9），本研究为假设生成性研究而非验证性研究。
目的：识别用于pT1a（黏膜层）ESCC的LNM风险评估的潜在生物标志物。
方法：对中国pT1a（黏膜层）ESCC患者（n = 9，LNM+ n = 5，LNM- n = 4）的临床标本进行转录组学分析。所有样本在同一批次中处理，未进行批次效应归一化。RNA完整性通过RIN（RNA完整性指数）评估，阈值为≥7.0，每个样本至少产生10 Gb数据（≥3200万条读段/样本；每个样本的平均读段数和范围见补充表2）。通过全面的转录组学分析系统表征了与LNM相关的分子特征。关键发现在同一组临床标本上通过定量PCR（qPCR）进行验证。来自癌症基因组图谱（TCGA）的公开数据（主要包含T1/T2期白种人患者，与中国训练队列不完全匹配）被纳入以评估预测性能。
结果：鉴定出两条显著失调的信号通路，并在转录组学分析中发现五个与LNM相关的主要表达变化（TPTEP1、ERAP2、ADAMTS16、CST4和PRSS8），并在相同样本中通过qPCR确认。基于这些生物标志物，开发了一个初步预测模型以评估早期ESCC的转移风险。尽管该模型显示出有前景的预测能力，但仍需更大规模的独立数据集进行进一步优化。
结论：本研究加深了对早期ESCC中LNM分子机制的理解，并识别出具有转移风险评估潜在效用的候选生物标志物。这些发现属于探索性结果，需要在更大规模的独立队列中验证，特别是在中国人群中。这些发现可能支持为早期ESCC患者制定更精准和个性化的治疗策略。
论文解读
一、研究背景与问题
食管癌（EC）是全球高发恶性肿瘤之一，发病率居第七位，癌症相关死亡率居第六位，每年约导致54万人死亡。中国占全球食管癌病例的约44%，其中食管鳞状细胞癌（ESCC）为主要组织学亚型。尽管诊断影像技术、外科手术和综合治疗手段不断进步，EC的长期预后仍不理想，5年生存率仅10%–30%。根治性食管切除术联合淋巴结清扫术仍是ESCC的标准治疗方案，而内镜成像联合切除术已成为pT1a（黏膜层）病变的替代选择。然而，临床分期、肿瘤分级、病变范围以及淋巴结转移（LNM）风险是评估内镜治疗适用性的关键决定因素。LNM是ESCC最重要的预后因素之一，在T1a（黏膜层）肿瘤中报告的发生率为7.0%–16.0%，在T1b（黏膜下层）肿瘤中为16.0%–41.1%。因此，在选择内镜切除术前，对LNM风险进行准确评估和个体化评估至关重要。既往研究多集中于临床变量（如肿瘤大小、位置、浸润深度、组织学分级和淋巴血管浸润），但尚未建立明确共识。近年来，多组学技术（包括单细胞RNA测序和空间转录组学）为识别早期ESCC中与LNM相关的分子特征提供了新途径，但由于转移的生物学复杂性，LNM的机制及其发生前的分子特征仍知之甚少。本研究旨在通过转录组学分析识别能够分层pT1a ESCC患者LNM风险的候选生物标志物，这些标志物有望在术前活检标本中检测，并结合临床病理参数指导治疗决策。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员从山西省汾阳医院收集了2024年3月至2025年6月期间接受手术的9例病理确诊为ESCC且分期为pT1a（黏膜层）的患者，共获得18对肿瘤-正常配对样本。其中5例患者存在淋巴结转移（LNM组），4例无淋巴结转移（非LNM组）。主要技术方法包括：转录组测序（RNA-seq）用于全转录组表达谱分析；定量实时PCR（qPCR）用于关键差异表达基因的验证；基因本体论（GO）和KEGG通路富集分析用于功能注释；基因集富集分析（GSEA）用于通路水平分析；STRING数据库用于蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建；随机森林和Lasso回归用于构建LNM风险预测模型；TCGA公共数据用于外部验证。
三、主要研究结果
1. 差异表达基因鉴定：通过比较肿瘤组织与癌旁正常组织，鉴定出3581个差异表达基因（DEGs）。进一步比较LNM组与非LNM组肿瘤，鉴定出59个DEGs。为排除肿瘤-正常组织差异带来的背景噪声，研究人员剔除了两组DEGs中重叠的39个基因，最终获得20个LNM特异性DEGs。层次聚类分析显示这些基因在两组间呈现明显不同的表达模式。
2. 功能富集与PPI分析：GO和KEGG富集分析显示，蛋白水解和脂质代谢相关通路是最显著富集的生物学过程。GSEA分析进一步确认泛素-蛋白酶体是最富集的基因集。PPI网络分析发现PRSS8-PPARA和ART4-LYPD5等相互作用对，其中PPARA和LYPD5显示出多个相互作用，提示其在转移网络中的核心调控作用。
3. qPCR验证：基于文献检索，研究人员从20个LNM特异性DEGs中筛选出5个既往在其他癌症类型中有转移相关证据的基因——TPTEP1、ERAP2、ADAMTS16、CST4和PRSS8，并在相同临床标本上进行qPCR验证。结果显示，TPTEP1、ERAP2、ADAMTS16和CST4在LNM阳性肿瘤中表达上调，而PRSS8在LNM病例中表达显著降低。尽管qPCR与RNA-seq在定量数值上不完全一致，但表达趋势一致，符合跨平台验证的方向一致性标准。
4. 预测模型构建：基于5个验证基因，研究人员采用Lasso和随机森林两种算法构建LNM风险预测模型。训练集中，Lasso模型的AUROC为0.779（P = 0.042），随机森林模型为0.776（P = 0.037）。然而，在TCGA独立验证队列中，两种模型的预测性能均下降（P > 0.05），随机森林模型表现出明显过拟合（训练AUROC 0.776 vs 验证AUROC 0.581），可能归因于极有限的训练样本量（n = 9）以及训练集（中国患者）与验证集（主要为白种人，且包含T1/T2期）之间的结构和人群差异。
四、讨论与结论
研究人员指出，肿瘤标本的异质性（含基质细胞、浸润淋巴细胞等正常成分）可能掩盖LNM特异性信号，因此采用减法策略去除肿瘤-正常差异信号，以富集LNM特异性DEGs。蛋白水解在转移中发挥基础性作用，肿瘤细胞需降解细胞外基质屏障以侵袭周围组织；脂质代谢虽传统上与肿瘤发生相关，但近期研究也涉及其在转移过程中的作用。关于PRSS8在LNM组中下调与既往报道（PRSS8抑制转移）不一致的现象，研究人员认为可能反映癌症类型特异性作用或分期/组织特异性调控机制。模型在验证队列中性能下降可能源于样本量小、人群差异、TCGA数据未区分T1/T2期以及跨平台技术变异等因素。研究人员强调，该5基因特征若能在更大队列中验证，理论上可应用于术前活检标本以分层pT1a ESCC患者的LNM风险，但当前模型尚不具备临床应用条件，需在中国独立队列中进行前瞻性验证。
研究结论：本研究通过转录组学分析加深了对早期ESCC中LNM分子机制的理解，识别出TPTEP1、ERAP2、ADAMTS16、CST4和PRSS8五个候选生物标志物，并揭示了蛋白水解和脂质代谢两条关键失调通路。这些发现属于探索性结果，需在更大规模的独立队列（尤其是中国人群）中验证，未来可能支持为早期ESCC患者制定更精准和个性化的治疗策略。
