AcWRKY75与AcMYB108介导ABA-GA拮抗调控菠萝内部褐变

《Molecular Horticulture》：AcWRKY75 and AcMYB108 mediated ABA-GA antagonism in the regulation of pineapple internal browning

　　

赤霉素（Gibberellic acid，GA）与脱落酸（abscisic acid，ABA）在多种生物学过程中表现出拮抗调控作用，但二者是否拮抗调控组织褐变尚不明确。本研究发现，ABA通过下调AcWRKY75和AcMYB108的表达抑制酚类物质生物合成，从而减轻菠萝内部褐变（internal browning，IB），而GA3则发挥相反作用。生化证据表明，AcWRKY75和AcMYB108可直接结合并激活酚类生物合成基因Ac4CL5。值得注意的是，AcMYB108可直接结合AcWRKY75启动子并激活其转录，表明AcMYB108作用于AcWRKY75上游。过表达AcWRKY75、AcMYB108或Ac4CL5的拟南芥植株表现出酚类生物合成增强。菠萝果实中瞬时过表达AcWRKY75可减轻IB，而瞬时沉默则增强IB及酚类积累。对瞬时过表达和沉默AcWRKY75的菠萝进行转录组分析发现，植物激素信号转导和苯丙烷生物合成是最显著富集的KEGG通路，提示AcWRKY75调控酚类生物合成涉及植物激素。ABA抑制而GA3增强由AcWRKY75、AcMYB108或Ac4CL5启动子驱动的GUS在烟草叶片中的瞬时表达酶活性。本研究提示WRKY75和MYB108参与ABA与GA在调控IB中的拮抗作用，为理解ABA和GA在植物组织褐变调控中的作用提供了新见解。

菠萝内部褐变的ABA-GA拮抗调控研究解读

一、研究背景与科学问题

脱落酸（abscisic acid，ABA）与赤霉素（gibberellins，GAs）在种子休眠与萌发、芽萌发、植物生长发育及逆境响应等多种生物学过程中表现出典型的拮抗调控关系。酚类化合物是植物中一类重要的次生代谢产物，其积累与组织褐变密切相关，尤其在果实衰老和采后贮藏过程中表现突出。菠萝内部褐变（internal browning，IB）是采后菠萝果实中一种重要的生理失调现象，严重影响果实品质和商品价值。我国主栽品种‘Comte de Paris’在常温（20 °C及以上）运输和销售过程中极易发生IB，造成重大经济损失。已有研究表明，外源GA₃可加剧菠萝IB，而外源ABA可缓解‘Comte de Paris’菠萝在常温下的IB。然而，ABA与GA在调控酚类生物合成和IB过程中的分子机制，特别是WRKY和MYB转录因子是否参与其中，尚不明确。因此，开展本研究以揭示ABA-GA拮抗调控菠萝IB的分子机制，具有重要的科学意义和应用价值。

二、研究内容与主要结论

研究人员首先通过外源ABA和GA₃处理菠萝果实，发现ABA显著减轻IB症状、降低褐变发生率和指数，而GA₃则加重褐变。蛋白质组和代谢组分析表明，苯丙烷生物合成途径是ABA与GA₃差异调控IB的关键通路，ABA抑制酚类生物合成，GA₃则促进酚类积累。转录组分析筛选出差异表达转录因子（differentially expressed transcription factors，DETF）AcWRKY75和AcMYB108，二者在ABA处理下下调、GA₃处理下上调，与酚类生物合成关键基因（AcC4H、Ac4CL5、AcHCT、AcCSE）表达模式一致。进一步通过瞬时过表达和沉默AcWRKY75验证其正向调控酚类积累和IB发生。在拟南芥中过表达AcWRKY75、AcMYB108或Ac4CL5均显著提高总酚含量（total phenolic content，TPC）和酚类生物合成基因表达。生化实验证明AcWRKY75和AcMYB108可直接结合并激活Ac4CL5启动子；同时AcMYB108可直接结合AcWRKY75启动子并激活其转录，表明AcMYB108位于AcWRKY75上游。启动子分析发现AcWRKY75、AcMYB108和Ac4CL5启动子均含有ABA响应元件（ABA responsive element，ABRE）和/或GA响应元件（GA responsive element，GARE），GUS瞬时表达实验证实ABA抑制而GA₃增强这些基因的转录活性。该研究揭示了ABA-GA通过拮抗调控AcWRKY75和AcMYB108及其靶基因Ac4CL5的转录，从而调控菠萝酚类生物合成和IB的分子机制，为培育抗褐变菠萝品种提供了理论依据。

三、主要技术方法

研究人员采用了多组学联合分析（蛋白组学和代谢组学）、转录组测序、实时荧光定量PCR、总酚含量测定、亚细胞定位、酵母单杂交（yeast one hybrid，Y1H）、双荧光素酶报告系统（dual-luciferase reporter，DLR）、凝胶迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）、农杆菌介导的菠萝果实瞬时过表达和病毒诱导基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）、拟南芥稳定转化及GUS报告基因瞬时表达等技术。样本来源于商业成熟度（70%成熟）的菠萝果实（品种‘Comte de Paris’），经ABA（0.2 g L^?1）或GA₃（0.2 g L^?1）喷施处理，常温（20 °C）贮藏9天。

四、研究结果

1. ABA和GA₃差异调控菠萝IB及苯丙烷生物合成途径

经ABA处理9天后，菠萝IB症状明显减轻，IB发生率和指数显著低于对照；GA₃处理则加重IB。蛋白组和代谢组分析显示，苯丙烷生物合成是ABA vs Control和ABA vs GA₃共同显著富集的KEGG通路。ABA下调了13个酚类合成关键酶蛋白中的12个，并降低7种酚类化合物中5种的丰度；GA₃则上调5个酶蛋白并提高3种酚类化合物含量。TPC测定结果与之一致，表明ABA抑制酚类合成，GA₃促进酚类积累，且酚类积累与IB严重程度正相关。

2. 筛选响应ABA或GA₃的候选转录因子

转录组分析在ABA vs Control和ABA vs GA₃中分别鉴定出55和65个差异表达转录因子，其中AcWRKY75、AcERF114和AcMYB108为共同的前三位。由于AcERF114与乙烯信号相关，而本研究聚焦ABA和GA，故选择AcWRKY75和AcMYB108进行深入研究。RT-PCR验证表明AcWRKY75和AcMYB108受GA₃上调、ABA下调，与酚类合成基因表达模式一致。共表达网络分析显示二者与9个酚类生物合成相关基因存在显著相关。亚细胞定位实验表明AcWRKY75和AcMYB108均定位于细胞核。

3. AcWRKY75通过激活Ac4CL5促进菠萝酚类积累

菠萝果实瞬时过表达AcWRKY75显著扩大褐变面积、提高AcWRKY75表达和TPC；瞬时沉默AcWRKY75则相反，褐变面积减小、表达降低、TPC减少。转录组分析显示，过表达和沉默AcWRKY75的菠萝中，次生代谢物生物合成、代谢途径、植物激素信号转导和苯丙烷生物合成是最显著富集的KEGG通路。Y1H、DLR和EMSA实验一致证明AcWRKY75特异性结合Ac4CL5启动子上的W-box基序并激活其转录。

4. 拟南芥过表达AcWRKY75和Ac4CL5增加酚类含量

构建AcWRKY75-OE和Ac4CL5-OE拟南芥株系，与空载体对照相比，OE株系TPC显著增加，酚类合成关键基因（AtC4H、At4CL、AtHCT、AtC3H、AtCSE）表达显著上调，进一步验证了AcWRKY75和Ac4CL5正调控酚类生物合成。

5. ABA和GA₃调控AcWRKY75和Ac4CL5的转录

AcWRKY75启动子含1个潜在ABRE基序，Ac4CL5启动子含4个ABRE和2个GARE基序。GUS瞬时表达实验表明，ABA处理降低由ProAcWRKY75、ProAcWRKY75-1、ProAcWRKY75-2驱动的GUS活性和表达，GA₃则提高ProAcWRKY75和ProAcWRKY75-2驱动的GUS表达。对Ac4CL5启动子分段实验显示，ABA抑制ProAc4CL5、ProAc4CL5-1和ProAc4CL5-3驱动的GUS表达，GA₃增强ProAc4CL5和ProAc4CL5-2驱动的GUS表达。结果表明ABA通过ABRE基序抑制，GA₃通过GARE基序激活AcWRKY75和Ac4CL5的转录。

5. 拟南芥过表达AcMYB108增加酚类含量

AcMYB108定位于细胞核。AcMYB108-OE拟南芥株系TPC显著高于EV对照，酚类合成基因（AtC4H、At4CL、AtHCT、AtC3H、AtCSE）表达均显著上调。

6. AcMYB108直接调控Ac4CL5表达

Y1H实验表明AcMYB108直接结合Ac4CL5启动子，但不结合AcC3H和AcCSE启动子。DLR实验和EMSA实验进一步证实AcMYB108通过识别Ac4CL5启动子中的MYB结合基序（CAACTG）激活其转录。

7. AcMYB108直接调控AcWRKY75表达

Y1H、DLR和EMSA实验均证明AcMYB108可直接结合AcWRKY75启动子（MYB结合基序CAACAG）并激活其转录，表明AcMYB108位于AcWRKY75上游。

8. ABA和GA₃调控AcMYB108的转录

AcMYB108启动子含2个ABRE和1个GARE基序。GUS实验显示，ABA处理抑制由ProAcMYB108、ProAcMYB108-1、ProAcMYB108-2、ProAcMYB108-3和ProAcMYB108-4驱动的GUS表达，GA₃则提高ProAcMYB108、ProAcMYB108-2和ProAcMYB108-4驱动的GUS表达，表明ABA抑制、GA₃激活AcMYB108的转录。

五、讨论与结论

讨论部分指出，ABA和GA₃通过拮抗调控苯丙烷生物合成途径，进而差异调控菠萝IB。蛋白组和代谢组分析表明，苯丙烷生物合成是ABA抑制IB的关键途径，ABA下调了13个酚类合成酶蛋白中的12个并减少酚类化合物积累，而GA₃则上调酶蛋白并增加酚类化合物。转录组分析鉴定出AcWRKY75和AcMYB108为关键转录因子，二者受GA₃诱导、受ABA抑制，且均能直接激活酚类生物合成基因Ac4CL5。此外，AcMYB108还能直接激活AcWRKY75的转录，形成协同调控网络。启动子分析及GUS实验证实ABA和GA₃分别通过ABRE和GARE基序直接调控AcWRKY75、AcMYB108和Ac4CL5的转录。该研究提出一个多层调控模型：Ac4CL5作为关键酚类合成基因，既受AcWRKY75和AcMYB108的转录激活，又受ABA和GA的拮抗调控；同时AcWRKY75受AcMYB108的转录激活，形成双重保障机制，确保酚类生物合成在菠萝采后过程中的重要性。该研究揭示了WRKY75和MYB108在ABA-GA拮抗调控植物组织褐变中的新作用，为培育抗褐变菠萝品种提供了分子靶点，也为理解ABA和GA在植物组织褐变调控中的角色提供了新见解。