《Veterinary Research》：PRRSV infection induces mitochondrial damage and releases mitochondrial dsRNA to activate the NLRP3-dependent inflammatory response
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猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起，至今仍是影响全球养猪业最具经济意义的传染病之一，仅在美国每年造成的损失就超过12亿美元。PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞（PAMs）并诱导严重的线粒体功能障碍，导致线粒体DNA（mtDNA）
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起，至今仍是影响全球养猪业最具经济意义的传染病之一，仅在美国每年造成的损失就超过12亿美元。PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞（PAMs）并诱导严重的线粒体功能障碍，导致线粒体DNA（mtDNA）释放。然而，PRRSV诱导的线粒体损伤作为损伤相关分子模式（DAMP）触发炎症反应的具体机制尚未完全阐明。本研究发现，高致病性PRRSV（HP-PRRSV）感染以剂量依赖和时间依赖的方式上调白细胞介素-1β（IL-1β）信使RNA（mRNA）表达及蛋白分泌。透射电子显微镜观察显示，HP-PRRSV感染过程中线粒体进行性肿胀、嵴结构紊乱及基质丢失。研究人员利用RNAscope结合MitoGreen染色发现，由线粒体DNA双向转录产生的线粒体双链RNA（mtdsRNA）在PRRSV感染期间被释放至胞质中。体外实验中，转录产生的mtdsRNA或从PAMs中分离的mtdsRNA可直接激活NLRP3炎症小体，诱导caspase-1裂解及IL-1β分泌。机制上，PRRSV编码的非结构蛋白11（nsp11）通过抑制含caspase募集结构域（CARD）的凋亡相关斑点样蛋白（ASC）的寡聚化来抑制NLRP3依赖性炎症反应，从而限制过度炎症，并在促炎信号与病毒免疫逃逸之间建立精细平衡。综上，研究结果将mtdsRNA鉴定为一种此前未被识别的线粒体DAMP，将PRRSV诱导的线粒体损伤与NLRP3炎症小体激活联系起来，同时揭示了nsp11在调节炎症中的反向调控作用。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起，是影响全球养猪业最具经济意义的传染病之一，仅在美国每年造成的损失就超过12亿美元，全球年损失超过25亿美元。PRRSV是一种有囊膜的正链RNA病毒，属于套式病毒目（Nidovirales）、动脉炎病毒科（Arteriviridae）。其基因组包含多个开放阅读框（ORFs），其中ORF1a和ORF1b约占基因组四分之三，编码14种非结构蛋白（nsp1α、nsp1β、nsp2-12），这些蛋白在病毒复制和宿主免疫调控中发挥多重作用。
PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞（PAMs）——病毒在体内的主要靶细胞——后诱导大量炎症细胞因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α）分泌。既往研究表明，PRRSV感染通过TLR4/MyD88信号通路经NF-κB增强pro-IL-1β表达，同时触发NLRP3炎症小体组装，导致IL-1β成熟和分泌。然而，将病毒复制与NLRP3激活联系起来的机制，以及精细调控这一反应的病毒策略，仍不完全清楚。
线粒体日益被认识为固有免疫的核心枢纽。在细胞应激条件下，线粒体成分——包括活性氧（ROS）、线粒体DNA（mtDNA）以及新近发现的线粒体双链RNA（mtdsRNA）——可泄漏至胞质并激活模式识别受体（PRRs），触发炎症级联反应。mtdsRNA由线粒体DNA重链和轻链的对称双向转录产生，结构上类似病毒双链RNA（dsRNA），因此特别容易激活免疫传感器。尽管PRRSV诱导的线粒体功能障碍已有充分记录，但mtdsRNA在PRRSV发病机制中的作用，以及病毒感染是否触发其释放以激活炎症小体，此前尚未被探索。
二、研究内容与主要结论
本研究系统阐明了PRRSV感染通过受损线粒体释放mtdsRNA激活NLRP3炎症小体的机制，同时鉴定出病毒蛋白nsp11作为抑制过度炎症的负调控因子。主要结论包括：HP-PRRSV感染以剂量和时间依赖方式上调IL-1β表达与分泌；感染引起进行性线粒体损伤（肿胀、嵴紊乱、基质丢失）；mtdsRNA从受损线粒体释放至胞质；合成及内源性mtdsRNA均可直接激活NLRP3炎症小体；nsp11通过直接结合ASC并抑制其寡聚化来抑制NLRP3依赖性炎症反应。该研究首次将mtdsRNA鉴定为PRRSV感染中连接线粒体损伤与NLRP3炎症小体激活的线粒体DAMP，揭示了促炎信号与病毒免疫逃逸之间的精细平衡。
三、主要技术方法
研究使用的主要技术方法包括：ELISA检测IL-1β和TNF-α分泌水平；qRT-PCR检测IL-1β mRNA表达；透射电子显微镜（TEM）观察线粒体超微结构变化；RNAscope结合MitoGreen染色追踪mtdsRNA定位；体外转录合成ND5基因不同长度片段（ND5-F200、ND5-F500、ND5-F1000、ND5-Full）的mtdsRNA；从PAMs中分离线粒体并纯化内源性mtdsRNA；HEK293T细胞NLRP3炎症小体重建系统筛选nsps；ASC寡聚化交联检测（DSS交联）；免疫共沉淀（Co-IP）检测蛋白互作；共聚焦显微镜及流式细胞术定量ASC斑点形成。PAMs分离自30日龄PRRSV阴性猪的支气管肺泡灌洗液；HP-PRRSV HuN4株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所田志军教授提供。
四、研究结果
HP-PRRSV诱导PAMs中IL-1β产生及NLRP3炎症小体激活。 通过ELISA和qRT-PCR分析发现，IL-1β分泌在感染后48小时（hpi）达到峰值，mRNA表达在36小时达到峰值，且呈剂量依赖性。利用siRNA敲低NLRP3后，pro-caspase-1裂解（p20片段）和IL-1β分泌均显著减少，证实该反应依赖NLRP3。
HP-PRRSV感染触发进行性线粒体损伤。 透射电子显微镜显示，与未感染对照中形态典型、嵴结构清晰的线粒体相比，PRRSV感染的PAMs中线粒体呈进行性损伤，表现为明显肿胀、嵴结构紊乱和基质密度降低，且随感染时间加重。
PRRSV感染期间线粒体双链RNA释放至胞质。 利用RNAscope结合MitoGreen染色，以线粒体ND5基因重链和轻链转录本为探针，发现在未感染PAMs中mtdsRNA主要与线粒体共定位；感染HP-PRRSV后，重链和轻链RNA信号出现在线粒体外部，表明mtdsRNA被释放至胞质。
mtdsRNA激活NLRP3炎症小体并诱导促炎细胞因子产生。 体外转录合成的四种不同长度ND5片段mtdsRNA转染PAMs后，在mRNA和蛋白水平均显著诱导IL-1β表达。从PAMs线粒体中纯化的内源性mtdsRNA同样诱导IL-1β和TNF-α产生。siRNA敲低NLRP3显著减弱mtdsRNA诱导的pro-caspase-1裂解和IL-1β分泌，证明mtdsRNA通过NLRP3炎症小体发挥作用。
PRRSV nsp11抑制NLRP3炎症小体依赖性IL-1β产生。 在HEK293T NLRP3炎症小体重建系统中系统筛选全部nsps，发现nsp11持续且强效地抑制IL-1β分泌，western blot证实其减少pro-caspase-1向活性p20形式的加工及成熟IL-1β（p17）的产生。该抑制作用呈剂量依赖性。在PAMs中过表达nsp11同样以剂量依赖方式抑制PRRSV诱导的IL-1β分泌。
nsp11通过抑制ASC寡聚化抑制炎症小体激活。 DSS交联实验显示nsp11过表达显著减少ASC寡聚体形成。Co-IP实验证实nsp11直接与ASC结合。共聚焦显微镜和流式细胞术定量均显示，在nigericin（Nig，一种公认的NLRP3炎症小体激动剂）刺激下，nsp11存在时ASC斑点阳性细胞显著减少。此外，nsp11表达显著降低mtdsRNA诱导的IL-1β分泌。
五、讨论与结论
本研究发现mtdsRNA是PRRSV感染中连接线粒体损伤与NLRP3炎症小体激活的线粒体DAMP，并揭示nsp11通过抑制ASC寡聚化限制过度炎症的病毒免疫逃逸机制。研究将mtdsRNA确立为一种此前未被识别的线粒体核酸DAMP物种，区别于既往报道的mtDNA激活NLRP3的途径。PRRSV编码的nsps在炎症小体调控中呈现双向作用：nsp2通过IKKβ依赖性途径促进NLRP3转位至分散的trans-Golgi网络以激活炎症小体；nsp5通过将NLRP3招募至内质网-线粒体界面、触发内质网应激和Ca2?泄漏激活NLRP3，同时将STING滞留于内质网以抑制I型干扰素诱导，形成PRRSV感染特征性的“高炎症、低干扰素”表型；而nsp11则通过阻断ASC寡聚化抑制炎症反应。这些相反作用的净效应决定了PRRSV感染的临床严重程度。研究结论为理解动脉炎病毒感染的线粒体DAMP生物学提供了新视角，也为靶向病毒免疫逃逸的治疗策略（如靶向nsp11 NendoU活性的小分子抑制剂）提供了理论基础。
