基于优化环状聚合酶延伸反应（CPER）的牛冠状病毒高效通用反向遗传系统及其抗病毒评估应用

《Veterinary Research》：An efficient and versatile reverse genetics system for bovine coronavirus facilitates antiviral evaluation

　　

牛冠状病毒（bovine coronavirus, BCoV）是犊牛腹泻的主要病原体，对呼吸道和肠道具有双嗜性。然而，由于缺乏便捷灵活的反向遗传学工具，BCoV基因功能和致病机制的研究受到限制。本文报道了一种基于优化的环状聚合酶延伸反应（circular polymerase extension reaction, CPER）方法建立的稳健BCoV反向遗传学系统。研究人员在HRT-18G细胞中成功拯救了重组BCoV（recombinant BCoV, rBCoV），并构建了表达ZsGreen荧光蛋白的重组病毒（rBCoV/Zs-T2A-ns2）。表型分析表明，未修饰的rBCoV和rBCoV/Zs-T2A-ns2均保持与野生型BCoV相当的生长动力学。重要的是，该报告病毒在传代超过十代后表现出显著的遗传稳定性，确定ns2位点是适合稳定外源基因表达的插入位点，且不影响病毒适应性或序列完整性。作为概念验证应用，研究人员将rBCoV/Zs-T2A-ns2用于抗病毒化合物评估，成功鉴定出四种能够有效抑制BCoV复制的化合物——卡莫司他（camostat）、萘莫司他（nafamostat）、氯硝柳胺（niclosamide）和奈非那韦（nelfinavir）。进一步的时间加药实验显示，奈非那韦和氯硝柳胺靶向BCoV复制阶段，而卡莫司他和萘莫司他干扰BCoV内化。这一基于CPER的通用反向遗传学系统为BCoV致病机制研究和新型疫苗及有效抗病毒疗法的加速开发提供了关键平台，最终有助于改善牛健康并促进可持续畜牧生产。

牛冠状病毒（bovine coronavirus, BCoV）是犊牛腹泻的重要病原，属β冠状病毒属，兼具呼吸道和肠道双嗜性，对全球养牛业造成重大经济损失。BCoV基因组约为31 kb，为正链单股RNA，5′端约三分之二编码复制酶多蛋白开放阅读框1ab（ORF1ab），其余部分编码血凝素酯酶（hemagglutinin esterase, HE）、刺突蛋白（spike, S）、包膜蛋白（envelope, E）、膜蛋白（membrane, M）和核衣壳蛋白（nucleocapsid, N）等结构蛋白，以及ns2、ns4.9、ns4.8、ns12.7等辅助蛋白。其中ns2蛋白定位于细胞质，可拮抗宿主干扰素反应，是病毒毒力和宿主互作的关键因子。然而，由于BCoV基因组庞大且部分序列在细菌宿主中不稳定，传统反向遗传系统如细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC）或酵母人工染色体系统、体外连接策略等操作费力且易引入不希望发生的突变，严重制约了BCoV基因功能和致病机制研究。近年来出现的无克隆组装方法，特别是环状聚合酶延伸反应（circular polymerase extension reaction, CPER），已成功用于SARS-CoV-2等冠状病毒感染性克隆的快速构建，但尚缺乏针对BCoV的CPER反向遗传系统。因此，建立一种高效、灵活、稳健的BCoV反向遗传工具，对于病毒学研究、疫苗和抗病毒药物开发具有重要意义。

本研究基于优化的CPER方法，建立了首个BCoV无克隆反向遗传系统。研究人员将BCoV XJ2023株基因组分为六个重叠片段，并与一个包含病毒3′非翻译区、HDV核酶（HDVr）、牛生长激素poly(A)信号、巨细胞病毒（CMV）启动子及病毒5′非翻译区的linker片段组装，在体外一步生成感染性环状DNA。转染稳定表达BCoV N蛋白的BHK-21-N细胞并与HRT-18G细胞共培养，成功拯救出重组病毒rBCoV，并进一步构建了表达ZsGreen荧光蛋白的报告病毒rBCoV/Zs-T2A-ns2。表型分析显示，rBCoV和报告病毒的生长动力学与野生型病毒相当；报告病毒在HRT-18G细胞中连续传代超过10代仍保持完整的ZsGreen表达和遗传稳定性，证实ns2基因上游是适合外源基因稳定插入的位点。利用该报告病毒进行抗病毒化合物评价，研究人员鉴定了卡莫司他（camostat）、萘莫司他（nafamostat）、氯硝柳胺（niclosamide）和奈非那韦（nelfinavir）四种可有效抑制BCoV复制的药物，并通过时间加药实验明确了它们各自作用的病毒生命周期阶段。该系统的建立为BCoV致病机制研究、新型疫苗开发和抗病毒药物筛选提供了关键平台，对提升牛健康和畜牧业可持续发展具有重要意义。

研究人员采用的关键技术方法包括：将BCoV XJ2023株（实验室分离保存）基因组分为六个重叠cDNA片段，并在pBR322载体中构建片段质粒；设计1135 bp的linker片段连接病毒末端，并携带HDV核酶、牛生长激素poly(A)信号和CMV启动子等转录元件；通过优化CPER反应条件，以每个片段0.1 pM的等摩尔浓度经聚合酶延伸一步组装全长环状DNA；将CPER产物直接转染稳定表达N蛋白的BHK-21-N细胞，随后与HRT-18G细胞共培养以拯救病毒；采用ZsGreen-T2A插入ns2上游的策略构建报告病毒；利用荧光显微镜和微孔板读数仪定量ZsGreen荧光；抗病毒评价采用10种已批准药物初筛，并对命中化合物测定半数抑制浓度（50% inhibitory concentration, IC₅₀）、半数细胞毒性浓度（50% cytotoxic concentration, CC₅₀）及进行时间加药实验。

研究结果如下。

无克隆组装BCoV全长基因组。研究人员将BCoV基因组分为F1-F6六个重叠片段，各约5-6 kb，并设计包含HDVr、bGH poly(A)、CMV启动子和病毒末端序列的1135 bp linker。通过设置不同片段浓度进行CPER反应，确定0.1 pM为最佳条件。琼脂糖凝胶电泳显示一条高于DNA marker的高分子量条带，对应组装的全长环状cDNA，证明单管CPER可高效组装BCoV全基因组。

在BHK-21-N细胞中高效拯救重组BCoV。CPER产物直接转染标准BHK-21或稳定表达BCoV N蛋白的BHK-21-N细胞，24小时后与HRT-18G共培养。结果显示BHK-21-N细胞显著加速病毒回收，在P1代即可检测到感染，而标准BHK-21细胞需额外一代。三次独立转染均成功获得感染性病毒，在HRT-18G上滴度约1×10⁷ TCID₅₀/mL。

重组BCoV的鉴定。rBCoV诱导的细胞病变与野生型BCoV一致，表现为细胞脱落、空泡形成并融合为合胞体；透射电镜观察到典型病毒颗粒。RT-PCR和Sanger测序验证了基因组片段与linker的精确连接，全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）确认全长序列完整，仅存在合成引入的同义突变（T29409C）和少量核苷酸变异。间接免疫荧光和Western blot证实病毒N蛋白表达；多步生长曲线显示rBCoV复制动力学与野生型相当。

产生表达ZsGreen的遗传稳定报告病毒。研究人员构建rBCoV/Zs-T2A-ns2，将ZsGreen基因插入ns2基因上游，通过源自Thosea asigna病毒的T2A自裂解肽实现与ns2的双顺反子共表达。感染细胞呈现绿色荧光，且与N蛋白共定位；RT-PCR扩增出预期大小片段，证明插入无误。生长曲线显示该报告病毒与rBCoV的复制动力学无显著差异。荧光强度随时间呈依赖性增加，反映病毒复制进程。连续传代至P10仍保持完整ZsGreen表达，P15时荧光显著下降，表明长期复制压力下外源基因可能丢失，但ns2位点仍是一个高稳定性插入位点。

利用rBCoV/Zs-T2A-ns2进行抗病毒化合物评估。研究人员选用十种FDA批准的广谱抗病毒化合物（包括病毒进入抑制剂、聚合酶抑制剂、3CL蛋白酶抑制剂和宿主靶向药物等），以5 μM终浓度初筛。依维菌素因明显细胞毒性被排除。卡莫司他、萘莫司他、氯硝柳胺、奈非那韦及阳性对照瑞德西韦显著抑制ZsGreen荧光。通过Western blot检测病毒S、N蛋白表达降低，RT-qPCR显示病毒N mRNA减少，TCID₅₀滴度下降，验证了荧光信号的可靠性。剂量依赖性实验测得IC₅₀均小于5 μM，CC₅₀均大于5 μM，表明具有良好选择性。

命中化合物对BCoV感染不同阶段的影响。时间加药实验显示，所有候选化合物均无直接杀病毒活性，也不影响病毒吸附。在内化阶段，卡莫司他和萘莫司他显著抑制病毒进入；在复制阶段，奈非那韦、氯硝柳胺和瑞德西韦显著抑制病毒RNA合成。因此，瑞德西韦、奈非那韦和氯硝柳胺作用于复制阶段，卡莫司他和萘莫司他靶向内化过程。

讨论部分总结了该系统的优势：CPER无需细菌克隆或体外转录，避免了传统BAC/YAC繁琐筛选和突变风险；BHK-21-N细胞可提高病毒RNA复制/转录，增加病毒产量。报告病毒通过保留ns2基因并融合T2A共表达策略，既维持野生型复制能力，又实现稳定外源表达，优于以往用ZsGreen替换ORF2的BAC来源报告病毒（其峰滴度减弱）。抗病毒筛选结果解释了不同机制：奈非那韦抑制3CL蛋白酶，氯硝柳胺为质子载体破坏酸性内体，卡莫司他和萘莫司他抑制TMPRSS2或furin蛋白酶，从而阻断内化；瑞德西韦作用于RdRp。需要注意某些化合物存在细胞毒性和较低选择性指数，如氯硝柳胺可降低细胞活力25%-30%，奈非那韦选择性指数（selectivity index, SI）约2；莫诺拉韦在低浓度无效，需高于50 μM才能完全抑制BCoV，提示BCoV可能具有高效校对外切酶活性或独特复制动力学。未来可扩展高通量筛选和组合策略。

研究结论：总之，研究人员成功建立了基于CPER的BCoV高效、灵活、稳健的反向遗传系统。该平台克服了以往体外病毒操作的技术障碍，能够快速产生重组病毒和报告病毒，为研究基因功能、筛选抗病毒药物以及开发新一代疫苗提供了不可或缺的工具，为深入理解BCoV致病机制和加速控制这一经济重要性疾病奠定了坚实基础。