《Veterinary Research》：Stepwise evolution of tigecycline resistance in Enterococcus hirae through early IS1216E-mediated tet(L) amplification and subsequent rpsJ mutations
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摘要 来自食用动物的肠球菌属（Enterococcus spp.）是抗菌药物耐药性的重要储存库；然而，替加环素耐药性的机制仍知之甚少。在本研究中，研究人员调查了海氏肠球菌（Enterococcus hirae）中替加环素耐药性的遗传基础及进化动态。从150份
摘要 来自食用动物的肠球菌属（Enterococcus spp.）是抗菌药物耐药性的重要储存库；然而，替加环素耐药性的机制仍知之甚少。在本研究中，研究人员调查了海氏肠球菌（Enterococcus hirae）中替加环素耐药性的遗传基础及进化动态。从150份猪源样本中分离到的118株肠球菌属（Enterococcus）分离株中，海氏肠球菌（E. hirae）是优势菌种（68/118，57.63%）。在10株分离株（10/118，8.47%）中鉴定出替加环素耐药性，所有这些分离株均属于同一个海氏肠球菌（E. hirae）克隆。对代表性分离株EG2361进行全基因组测序，发现了三个质粒，其中pEG2361-2携带一个与IS1216E相关的多药耐药区域，能够产生两个环状可转座单元（translocatable units，TUs）。TU1携带启动子变异的tet(L)位点以及tet(M)和poxtA，发生串联扩增，导致质粒结构异质性。功能分析表明，tet(L)降低了替加环素敏感性，而耐药性的增强主要与其上游启动子区域的变异有关，而非Tet(L)氨基酸替换。实验进化揭示了一个动态的耐药轨迹。替加环素耐药性的初始增加与TU1扩增及tet(L)表达的显著上调相关。随后，tet(L)表达下降，而替加环素最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentrations，MICs）保持升高且稳定。在进化谱系中独立出现了反复的rpsJ突变，并与高水平耐药性相关。总之，这些发现支持一个逐步进化的模型，在该模型中，插入序列（insertion sequence，IS）1216E介导的启动子变异tet(L)位点扩增驱动了快速的早期适应，随后出现染色体rpsJ突变，与稳定的高水平耐药性相关。本研究扩展了对肠球菌中替加环素耐药性进化的现有认识，并强调了可移动遗传元件、转录调控和染色体适应性在塑造抗菌药物耐药性中的相互作用。
论文解读：海氏肠球菌中替加环素耐药性的逐步进化机制
一、研究背景与科学问题
替加环素（tigecycline，TGC）作为一种甘氨酰环素类抗生素，通过与细菌30S核糖体亚基结合抑制蛋白质合成，是治疗耐万古霉素肠球菌（vancomycin-resistant enterococci，VRE）等多重耐药（multidrug-resistant，MDR）革兰阳性菌所致严重感染的重要药物。然而，近年来关于肠球菌对替加环素敏感性降低的报告日益增多，威胁其临床效用。尽管替加环素未被批准用于中国兽医临床，但四环素类药物（如多西环素和金霉素）在畜牧业中广泛使用，可能共选择出对替加环素敏感性降低的耐药决定因子。食用动物因此成为此类耐药决定因子的潜在储存库，具有公共卫生意义。
肠球菌是人和动物胃肠道的常见共生菌，也是重要的机会致病菌。其中，海氏肠球菌（Enterococcus hirae）常从动物中分离，并被认为是抗菌药物耐药性决定因子的重要储存库。然而，该物种中替加环素耐药性的进化机制在很大程度上尚不清楚。此前研究表明，替加环素耐药性通常与三类机制相关：靶位点改变（如由rpsJ编码的核糖体蛋白S10突变）、药物外排泵增加，以及获得可转移的耐药基因（如tet(X)、tmexCD-toprJ）。此外，经典的四环素耐药决定因子，如金黄色葡萄球菌中的tet(L)变异体和猪链球菌中的tet(M)变异体，也被发现与替加环素最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）升高有关。这些基因常与插入序列（insertion sequence，IS）1216/IS1216E样元件相关联，后者可通过重组介导基因动员和结构重排。然而，IS1216E相关耐药区域的结构可塑性是否有助于肠球菌中替加环素耐药性的适应性进化，仍有待探索。
本研究旨在调查中国河南省某养猪场肠球菌分离株的抗菌药物耐药谱，特别是针对替加环素耐药的海氏肠球菌（E. hirae），并进一步阐明其替加环素耐药性的遗传基础和适应性进化机制，为理解动物源肠球菌中替加环素耐药性的出现和进化提供新见解。
二、关键技术方法
研究人员于2023年12月从中国河南省某养猪场的健康猪只采集了150份样本（75份直肠拭子和75份咽拭子），从中分离出118株肠球菌属（Enterococcus）分离株。采用肉汤微量稀释法测定分离株对抗菌药物的敏感性。对替加环素耐药的海氏肠球菌（E. hirae）分离株进行脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）评估克隆相关性。选取代表性菌株EG2361进行全基因组测序，结合Illumina短读长和Oxford Nanopore长读长技术，并进行生物信息学分析。通过反向PCR和Sanger测序检测环状可转座单元（translocatable units，TUs）。利用S1核酸酶脉冲场凝胶电泳（S1-PFGE）和Southern印迹杂交分析质粒大小变化。通过克隆实验和肉汤微量稀释法表征tet(L)变异体及其启动子的功能。开展为期40代（20天）的替加环素压力下适应性进化实验，随后进行20代（10天）无药传代以评估耐药稳定性，期间通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）监测基因表达水平，并通过PCR和测序检测rpsJ基因突变。
三、研究结果
1. 肠球菌属（Enterococcus spp.）在不同样本来源中的分离率和菌种分布**
从150份猪源样本中共分离到118株肠球菌属（Enterococcus）分离株，总分离率为78.7%。海氏肠球菌（E. hirae）是优势菌种（68/118，57.63%），其次是粪肠球菌（E. faecium）（18/118，15.25%）、耐久肠球菌（E. durans）（14/118，11.86%）、铅黄肠球菌（E. casseliflavus）（11/118，9.32%）、蒙氏肠球菌（E. mundtii）（4/118，3.39%）和粪肠球菌（E. faecalis）（3/118，2.54%）。海氏肠球菌（E. hirae）几乎完全从直肠拭子中分离（67/68，98.53%），而铅黄肠球菌（E. casseliflavus）和蒙氏肠球菌（E. mundtii）则仅从咽拭子中回收，表明不同菌种对不同解剖部位具有强烈的定植偏好。
2. 肠球菌属（Enterococcus spp.）的抗菌药物耐药谱及低但种属限制性的替加环素耐药性**
所有分离株对氟苯尼考（florfenicol，FFC）（78.81%）和林可霉素（lincomycin，LIN）（76.27%）的耐药率最高，其次为多西环素（doxycycline，DOX）（66.10%）、恩诺沙星（enrofloxacin，EN）（62.71%）和泰乐菌素（tylosin，TYL）（61.86%）。替加环素（tigecycline，TGC）耐药率较低（8.47%），所有分离株对万古霉素和利奈唑胺完全敏感。值得注意的是，所有替加环素耐药菌株均为海氏肠球菌（E. hirae）。海氏肠球菌（E. hirae）对多种抗生素类别表现出广泛升高的耐药率，包括氟苯尼考、多西环素、恩诺沙星、泰乐菌素和林可霉素（均接近或达到100%）。
3. 海氏肠球菌（E. hirae）EG2361中替加环素耐药性的基因组基础**
PFGE分析显示10株替加环素耐药的海氏肠球菌（E. hirae）分离株具有相同的带型，表明它们密切相关。代表性菌株EG2361的基因组由一个携带氨基糖苷类耐药基因aac(6′)-Iid的染色体和三个质粒组成。质粒pEG2361-2是一个Inc18型质粒，携带poxtA、tet(L)、tet(M)和fexB，分别与酰胺醇类、四环素类和噁唑烷酮类耐药性相关。详细分析显示，pEG2361-2上的tet(L)-tet(M)区域和poxtA模块均被同向的IS1216E元件侧翼包围，形成典型的IS1216E-耐药基因-IS1216E结构。反向PCR和Sanger测序证实存在两种环状可转座单元（TUs）：TU1（约11.5 kb）携带tet(L)-tet(M)-IS1216E-poxtA-IS1216E，以及TU2（约3.3 kb）由poxtA-IS1216E模块组成。
4. TU1扩增驱动的质粒pEG2361-2结构异质性
对EG2361的十个随机单菌落进行S1-PFGE分析，发现所有菌落均持有一个保守的约138 kb质粒（对应pEG2361-1），同时另一个质粒（对应pEG2361-2）表现出从约45 kb到约155 kb的显著大小变异，差异约为11 kb的整数倍。Southern印迹杂交证实tet(L)和poxtA均位于该可变质粒上。观察到的约11 kb增量与TU1的长度（约11,485 bp）高度吻合，表明TU1的串联扩增导致了质粒大小的变化。对Oxford Nanopore长读长的重新分析揭示了包含1至9个串联拷贝TU1的阵列，每个TU1单元携带tet(L)、tet(M)、poxtA和两个同向IS1216E元件。
5. tet(L)v启动子变异对替加环素耐药性的贡献
与参考序列相比，来自替加环素耐药菌株EG2361的tet(L)含有七个氨基酸替换（Y5F、D43Y、P47T、V94L、V127I、S169Y和H287Y），因此被命名为tet(L)v。此外，tet(L)v上游启动子区域相对于野生型tet(L)也存在显著序列变异。在大肠杆菌DH5α中的功能分析表明，单独表达tet(L)或tet(L)v均可使替加环素MIC提高2倍，但两者之间无显著差异。然而，当包含tet(L)v上游启动子区域时，替加环素MIC额外增加了2倍，而包含野生型启动子的构建体未观察到变化。这表明增强的替加环素耐药性主要与启动子变异相关，而非tet(L)编码序列的改变。
6. 启动子变异tet(L)v的扩增驱动海氏肠球菌（E. hirae）EG2361中早期的替加环素耐药性进化**
在替加环素压力下的适应性进化实验中，三个独立进化谱系的替加环素MIC随时间逐渐升高，在第17.5天达到64 mg/L，较亲本菌株提高了64倍。撤除替加环素后，高MIC值在随后的10天无药传代中保持稳定（64 mg/L）。对照谱系的MIC在整个过程中未发生变化。S1-PFGE分析显示，进化过程中pEG2361-2的大小显著增加（从约122 kb增至超过244 kb），与TU1的大量串联扩增一致。RT-qPCR分析显示，在所有进化谱系中，tet(L)表达水平在早期急剧上升，在第12.5天达到峰值（800-1100倍），随后逐渐下降，但在撤药后急剧下降至基线水平的约5-10倍。值得注意的是，tet(L)表达的峰值早于最高替加环素MIC的达成时间（第17.5天），且当tet(L)表达下降后，MIC仍维持在高水平。
7. 反复出现的rpsJ突变与晚期进展为高水平替加环素耐药性相关
在进化实验的早期阶段（第0天至第7.5天），所有三个谱系中均未检测到rpsJ基因突变。从第12.5天开始，所有进化谱系中均出现了rpsJ的非同义突变，主要集中在第57位残基（K57N、K57R、K57I），此外还在Tb谱系的一个菌落中检测到A54E替换。在后期时间点，Tb谱系获得了额外的H56R替换，形成双突变。这些突变在无药传代期间持续存在，与耐药表型的稳定维持相一致。结果表明，rpsJ突变，尤其是影响第57位残基的突变，在进化后期出现，并与高水平替加环素耐药性的建立密切相关。
四、讨论与结论
讨论部分指出，本研究发现的所有替加环素耐药海氏肠球菌（E. hirae）分离株均密切相关，提示克隆扩张可能在该养殖场环境中促进了替加环素耐药性的出现。质粒pEG2361-2上多个耐药基因的共定位可能有利于在不同抗菌药物压力下的共选择。重要的是，本研究首次证明IS1216E介导的串联扩增可以自然发生在猪源海氏肠球菌（E. hirae）分离株携带的耐药质粒上，揭示了在无实验操作条件下的内在结构可塑性。这种预先存在的异质性为快速适应提供了遗传储备，在替加环素选择压力下，具有更高TU1拷贝数的亚群被优先富集，从而导致耐药性。功能分析强调，增强的替加环素耐药性主要源于tet(L)v上游启动子区域的变异，而非氨基酸替换，表明调控变化在塑造耐药表型中发挥核心作用。
实验进化揭示了一个逐步的耐药性进化轨迹：早期阶段，IS1216E介导的携带启动子变异tet(L)v位点的TU1串联扩增导致tet(L)表达显著上调，驱动耐药性的初始增加；随后，tet(L)表达下降，而染色体rpsJ突变独立出现并在所有谱系中固定，与稳定高水平耐药性的维持相关。这支持一个模型：基因扩增作为快速反应的适应性机制，而靶位点突变则代表后期稳定高水平耐药性的适应性途径。
研究结论： 本研究揭示了海氏肠球菌（E. hirae）中替加环素耐药性的逐步进化途径，涉及IS1216E介导的启动子变异tet(L)v位点串联扩增，随后出现与稳定高水平耐药性相关的染色体rpsJ突变。这些发现强调了可移动遗传元件、转录调控和染色体适应性之间的相互作用，并突出了基因组结构可塑性在推动临床和农业环境抗菌药物耐药性进化中的重要性。
