原发灶与转移灶皮肤黑色素瘤的DNA甲基化谱分析及与临床结局的关系

《Journal of Translational Medicine》：Impact of methylation and mutation modifications on melanoma progression through evaluation of paired primary and secondary lesions from same patients

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癌症的进展和转移远远超出了单纯的基因突变范畴，同样受到宿主免疫系统失调对肿瘤微环境（TME）的影响以及表观遗传学改变的共同驱动，从而促进免疫逃逸并推动转移性扩散^[1]。为了更好地阐明肿瘤分子景观对转移过程的影响，我们对一组晚期皮肤黑色素瘤患者的配对原发灶和转移灶样本进行了突变和甲基化谱分析。在该队列中，我们团队近期展示了同一患者原发性和转移性黑色素瘤之间异质性TME免疫表型分布的预后意义，并发现转移灶样本中（而非原发灶中）的BRAF突变与更强的免疫抑制表型相关^[2]。在此，我们进一步探讨了黑色素瘤进展过程中甲基化谱与致病基因突变之间的关系，并对同一队列中甲基化类别与临床结局的相关性进行了探索。

对38例黑色素瘤患者的76例配对原发灶和首次发现的转移灶样本进行了分子分析（补充表^S1）；在纳入研究时，所有患者均已表现为转移性疾病。通过基于NGS的检测方法评估了517个参与关键致癌通路的基因的突变状态。对于甲基化分析，采用了RRBS测序方法，并鉴定了差异甲基化的CpG岛。将显著差异甲基化区域（DMRs）标注在热图上。

在同一患者的原发黑色素瘤及其相应转移灶之间，控制细胞增殖和存活的主要分子通路（MAPK、PI3K/AKT和INK4/ARF）的突变状态未观察到具有统计学意义的差异（补充表^S2）。总体而言，样本间存在差异的患者比例为：BRAF 6/38（15.8%），NRAS 3/38（7.9%），PI3K/AKT 8/38（21.1%），INK4/ARF 9/38（23.7%）（补充表^S2）。考虑到肿瘤突变负荷（TMB），原发和转移性黑色素瘤之间确实观察到具有统计学意义的差异：在存在差异的病例中，7例原发灶TMB高而转移灶不高，而仅有1例呈现相反模式（p = 0.003）。总体而言，三分之二的患者（25/38；65.8%）的原发黑色素瘤TMB较高（> 10 mutations/Mb）；其中四分之一（7/25；28%）的配对转移灶中TMB较低（补充表^S2）。这表明原发肿瘤中的高TMB并非在相应转移灶中得以维持，这一现象可能部分解释了进展过程中肿瘤免疫原性的降低，并参与了我们团队此前所描述的转移性免疫抑制状态^[2]。

RRBS甲基化检测后的主成分分析（PCA）显示原发肿瘤样本与转移灶样本之间存在显著分离，且转移后甲基化水平有所下降（p < 0.01）（图¹A）。原发肿瘤的甲基化率与远处转移的解剖学部位之间未发现相关性。此外，甲基化水平与TMB率（p = 0.109）、BRAF突变（p = 0.951）或黑色素瘤发生的主要通路改变（MAPK、PI3K/AKT、INK4/ARF）（p ≥ 0.5）均无相关性。这些发现表明，此类表观遗传学改变可能独立于细胞内分子状态而发生。

图 1

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甲基化数据分析。A，原发灶（P）和转移灶（M）黑色素瘤之间的甲基化水平PCA分析（N = 62；排除了14个异常值）。B，低甲基化（左；亚型2）、CIMP（中；亚型3）和中间型（右；亚型1）。展示了DMR类别。Stage_dia，诊断时的AJCC分期；Stage low，AJCC I/II期；Stage high，AJCC III/IV期。

DMR分析揭示了一个支持黑色素瘤进展的一致表观遗传程序。如补充表^S3所述，晚期患者（IIIB-IV期）的样本显示了两个主要的差异甲基化基因群：a) 肿瘤抑制因子和细胞生长抑制基因的高甲基化，促进增殖和去分化^[3]；b) 参与细胞骨架重塑、侵袭和神经信号通路的基因的低甲基化，反映了黑色素瘤细胞公认的神经营养样重编程，从而增强转移潜力^[4]。

原发肿瘤样本被聚类为三种主要甲基化亚型：低甲基化（Low）、中间甲基化（Intermediate）和CpG岛甲基化表型（CIMP）（图¹B）。分别对38例和36例患者的队列分析了原发肿瘤甲基化类别对总生存期（OS）和无进展生存期（PFS；指从原发黑色素瘤诊断到首次复发出现的时间）的影响。

对于OS，log-rank检验显示三组之间无显著差异（p = 0.36）（补充图^S1A）。单因素Cox模型证实无统计学显著性，Intermediate vs. Low的风险比（HR）为0.56（p = 0.196），CIMP vs. Low的HR为1.05（p = 0.921）。对于PFS，各组之间同样未观察到显著差异（p = 0.6）（补充图^S1B）。单因素Cox模型中，Intermediate vs. Low的HR为0.67（p = 0.361），CIMP vs. Low的HR为0.73（p = 0.547）。

当将OS分析的Low和CIMP病例合并为单一类别时，log-rank检验显示的趋势强于三组比较，但未达到统计学显著性（p = 0.15）（图²）。

图 2

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根据两种甲基化类别（Low和CIMP vs. Intermediate组）的患者总生存期

甲基化类别似乎不能作为生存的显著预测因子，尽管Low和CIMP组的死亡风险较高（25例中有21例事件发生；84%），而Intermediate组为7/13（54%）（HR 1.81；p = 0.161）。样本量小仍然是识别具有统计学显著性差异的主要局限。然而，中间甲基化类别生存期更长的趋势值得关注，值得在更大样本量的进一步研究中进行验证。