基于代谢工程策略实现谷氨酸棒状杆菌可持续从头合成异丁胺

《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》：Metabolic engineering strategies for sustainable de novo isobutylamine production by Corynebacterium glutamicum

　　

摘要专业翻译 背景：短链伯胺（SCPAs）是生物系统中一类功能多样的分子，由氨基酸脱羧或含羰基分子的转氨作用生成。异丁胺是L-缬氨酸的脱羧产物，在药物、除草剂、杀菌剂及特种化学品的化学合成中具有应用价值，尤其可作为石油化工化合物的替代品。由于短链伯胺的化学合成存在危险且对环境不可持续，本研究建立了一种高效的生物合成途径。 结果：天然氨基酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）是生产氨基酸衍生分子的理想底盘菌株。本研究评估了多种相关短链伯胺对谷氨酸棒状杆菌的毒性。粗提物测定实验证明，来自绿色链霉菌（Streptomyces viridifaciens）的L-缬氨酸脱羧酶VlmDSv可将L-缬氨酸脱羧生成异丁胺。该酶被用于扩展三株工程菌株中丙酮酸的代谢通路，进而生产L-缬氨酸并随后生成异丁胺。为确保胞内L-缬氨酸供应，通过敲除支链氨基酸外排蛋白BrnFECg编码基因和/或过表达L-缬氨酸导入蛋白基因brnQCg，使胞外L-缬氨酸积累量降低达20倍。出乎意料的是，来自大肠杆菌（Escherichia coli）的转氢酶基因pntABEc的表达并未提高异丁胺产量，反而使其大幅降低。生化分析揭示，pntABEc的表达使膜电位去极化。 结论：本研究实现了在最低培养基中异丁胺的最高产量，以及任何微生物短链伯胺的最高产量。在摇瓶培养中，异丁胺滴度达到12.1 g/L，产率为0.74 mol异丁胺/mol葡萄糖。成功放大至3 L补料分批生物反应器发酵，64小时内滴度达到33.2 g/L，产率为0.47 mol/mol，体积生产率为0.52 g/L/h。此外，研究还展示了利用第二代原料生产异丁胺的能力，凸显了异丁胺可持续生物基生产的潜力。

论文解读

一、研究背景与意义

大宗化学品的生产高度依赖有限的石油化工原料，这从根本上阻碍了可持续循环经济的实现。脂肪胺是多种化学工业中极为重要的一类化合物，2024年市场规模达38亿美元，预计2033年将增至57亿美元。值得注意的是，超过40%的小分子药物可归类为胺类化合物，且它们是农用化学品中杀虫剂、除草剂和杀菌剂合成的重要前体。目前脂肪胺的生产主要通过对化石来源的羰基化合物进行还原胺化实现，存在反应条件苛刻、原料不安全、过程能耗高等问题，因此开发生物基替代路线具有重要意义。

短链伯胺（SCPAs）是指烷基或芳基链长为1–7个碳的胺类化合物，通常由醛或酮的酶促转氨作用或氨基酸的脱羧反应生成。异丁胺作为L-缬氨酸的脱羧产物，在工业上广泛用作缓蚀剂、橡胶加工化学品、抗爆剂以及复杂化合物合成的前体。然而，异丁胺的化学合成路线存在安全隐患和环境不可持续问题，亟需开发高效的生物合成方法。

二、研究目标与策略

研究人员以天然氨基酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）为底盘菌株，旨在建立一条从可再生碳源到异丁胺的高效生物合成途径。研究首先评估了多种短链伯胺对谷氨酸棒状杆菌野生型的毒性，确认该菌株对异丁胺具有较高耐受性（抑制常数K_i = 0.23 M），适合作为异丁胺的生产宿主。随后，研究人员利用来自绿色链霉菌的L-缬氨酸脱羧酶VlmD_Sv，在三株丙酮酸生产菌株（ELB-P、ISO-P和A16-P）中建立了从丙酮酸经L-缬氨酸到异丁胺的合成通路，并通过代谢工程手段提高前体L-缬氨酸的胞内供应，最终实现异丁胺的高效生产。

三、关键技术方法

研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用粗提物酶活测定法验证VlmD_Sv的L-缬氨酸脱羧活性；通过基因敲除和质粒过表达对谷氨酸棒状杆菌进行代谢工程改造，包括敲除支链氨基酸外排系统基因brnFE_Cg、过表达L-缬氨酸导入蛋白基因brnQ_Cg以及L-缬氨酸合成基因簇ilvBNCD_Cg；利用高效液相色谱（HPLC）对胺类和碳水化合物进行定量分析；采用DiOC₂(3)荧光染料结合流式细胞术分析细胞膜电位变化；最后在3 L补料分批生物反应器中进行放大发酵验证。

四、研究结果

短链伯胺对谷氨酸棒状杆菌野生型生长的影响：研究人员在Duetz深孔板中考察了多种直链和支链短链伯胺对谷氨酸棒状杆菌野生型（ATCC 13032）生长的影响。结果表明，胺的毒性随烷基链长度增加而增强，异丙胺的K_i值（0.4 M）为其直链异构体丙胺（0.2 M）的两倍。铵离子在测试浓度范围内无毒性效应，而异丁胺的K_i值为0.23 M，表明谷氨酸棒状杆菌对该化合物具有较高耐受性。

L-缬氨酸体外脱羧生成异丁胺：通过粗提物酶活测定实验验证了VlmD_Sv的脱羧活性。在pH 7、30 °C条件下以20 mM L-缬氨酸为底物孵育60分钟，携带vlmD_Sv的粗提物中异丁胺浓度随孵育时间增加而升高，最终达到20.8 ± 0.7 mM（100%蛋白浓度），而空载体对照未检测到异丁胺生成。粗提物酶活计算为0.4 ± 0.1 U mg^-1，表明VlmD_Sv适用于体内异丁胺生产。

在三株丙酮酸生产菌株中建立异丁胺生产：研究人员将携带vlmD_Sv和ilvE_Cg的生产质粒转化至三株丙酮酸生产菌株。A16-P衍生菌株在不添加L-缬氨酸时产生1.1 ± 0.4 mM异丁胺，添加20 mM L-缬氨酸后滴度提高约三倍至3.2 ± 0.7 mM。而ISO-P和ELB-P衍生菌株未检测到异丁胺产生，表明在这两株ΔaceE菌株中过表达ilvBNCD_Cg对于异丁胺生产是必要的。

增加前体供应的代谢工程：通过引入L-缬氨酸合成质粒pJC4ilvBNCD_Cg–pntAB_Ec和敲除外排基因brnFE_Cg来增加胞内L-缬氨酸供应。添加BCAA生产质粒后，A16-P衍生菌株的异丁胺和L-缬氨酸滴度分别提高约三倍至3.4 ± 0.3 mM和48.7 ± 6.9 mM。然而，敲除brnFE_Cg虽使胞外L-缬氨酸积累降低约六至七倍，但异丁胺滴度也显著下降，A16-P衍生菌株降至0.5 ± 0.1 mM，表明brnFE_Cg缺失导致胞内L-缬氨酸积累增加并造成细胞应激。

异源PntAB表达对异丁胺生产和膜电位的影响：研究人员发现，去除pntAB_Ec后，携带pJC4ilvBNCD_Cg的A16-P衍生菌株异丁胺产量大幅提高至约120–140 mM（48小时）。敲除brnFE_Cg或过表达brnQ_Cg均显著提高滴度，但两者组合无叠加效应。72小时后最高滴度达165.7 ± 4 mM。膜电位分析表明，pntAB_Ec表达导致细胞膜去极化，从而抑制了异丁胺生产。

利用VlmD底物混杂性生产3-甲基丁-1-胺：利用VlmD_Sv的底物宽泛性，研究人员在携带leuA_Cg^G462D的菌株中实现了3-甲基丁-1-胺的生产。敲除brnFE_Cg使滴度显著提高至0.61 ± 0.1 mM，而过表达brnQ_Cg无显著影响。

第二代原料生产异丁胺：研究人员在最佳生产菌株中引入木糖利用质粒pEKEx3–xylA_XcB_Cg，实现以木糖和橙皮水解液为碳源的异丁胺生产。以木糖为唯一碳源时最高产生87 ± 9 mM异丁胺，以橙皮水解液培养时最高产生44.2 ± 3.9 mM，但均低于葡萄糖对照（173.9 ± 20.7 mM）。

3 L补料分批生物反应器放大发酵：最佳菌株A16-P ΔbrnFE (pJC4ilvBNCD_Cg) (pECXT99A–vlmD_Sv–brnQ_Cg)在3 L补料分批发酵中64小时达到454 mM（33.2 g/L）异丁胺，产率为0.47 mol/mol，体积生产率为0.52 g/L/h，较摇瓶培养（166 mM，12.1 g/L）提高近三倍。

五、讨论与结论

研究人员通过敲除brnFE_Cg和过表达brnQ_Cg改善了L-缬氨酸的胞内供应，从而提高了异丁胺产量。利用第二代原料（木糖和橙皮水解液）生产异丁胺的可行性已得到验证，但滴度低于葡萄糖，可能与磷酸戊糖途径氧化分支的NADPH供应差异以及橙皮水解液中5-羟甲基糠醛的抑制效应有关。异源表达pntAB_Ec编码的质子易位NAD(P)⁺转氢酶（EC 7.1.1.1）虽预期通过膜电位驱动的NADPH供应增加来提高异丁胺产量，但实际上导致膜电位去极化，大幅降低了产量。研究还发现，胞外异丁胺的添加可导致细胞膜超极化，这可能与其以未质子化形式扩散进入胞内后消耗质子有关。

本研究实现了在最低培养基中异丁胺的最高微生物产量，也是任何微生物短链伯胺的最高产量。摇瓶培养中异丁胺滴度达12.1 g/L，产率为0.74 mol异丁胺/mol葡萄糖；3 L补料分批发酵中64小时滴度达33.2 g/L，产率为0.47 mol/mol，体积生产率为0.52 g/L/h。此外，研究还展示了利用第二代原料生产异丁胺的能力，凸显了异丁胺可持续生物基生产的潜力。