《Metabolomics》：Metabolic profiling of retinal organoids reveals conserved core metabolites and alterations in glycolytic and amino acid metabolism
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专业翻译摘要：视网膜类器官已 emerging 为视网膜发育和疾病研究的强大模型；然而，它们在多大程度上重现天然视网膜的代谢景观仍 largely 未知。本研究旨在比较小鼠视网膜和小鼠胚胎干细胞来源的视网膜类器官（mouse retinal organoids
专业翻译摘要：视网膜类器官已 emerging 为视网膜发育和疾病研究的强大模型；然而，它们在多大程度上重现天然视网膜的代谢景观仍 largely 未知。本研究旨在比较小鼠视网膜和小鼠胚胎干细胞来源的视网膜类器官（mouse retinal organoids, MROs）的代谢组学谱，并评估类器官成熟过程中的代谢变化。研究采用基于非靶向气相色谱-质谱联用（gas chromatography mass spectrometry, GC-MS）的代谢组学分析方法，对出生后第3天的小鼠视网膜和分化第28天的MROs进行细胞内代谢物 profiling，同时收集类器官成熟过程中的条件培养基进行分析。结果表明，在小鼠视网膜和视网膜类器官中共纳入166种注释化合物，其中148种为两种样本类型共有。通过双向倍数变化阈值进行差异分析显示，MROs保留了与小鼠视网膜共享的大量代谢特征；然而，在糖酵解相关代谢物和磷酸戊糖中间体（包括葡萄糖-6-磷酸和核酮糖-5-磷酸）以及三羧酸循环相关代谢物（包括柠檬酸、富马酸和草酸）的丰度上观察到选择性差异。通路富集分析发现丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢存在显著改变。培养基分析进一步揭示了类器官成熟过程中细胞外谷氨酸和甘氨酸丰度的阶段依赖性变化。结论：MROs保留了视网膜代谢组织的主要组分，同时表现出与天然视网膜相比代谢成熟不完全的特征。这些发现为MROs的代谢保真度提供了有价值的见解，并为未来优化策略提供了指导。
论文解读文章：
视网膜是体内代谢最活跃的组织之一，其正常功能依赖于能量产生、氧化还原稳态和生物合成能力的精密协调，以支持光转导、突触传递和持续的外节更新。光感受器细胞高度依赖有氧糖酵解、线粒体氧化磷酸化和脂质代谢，而Müller胶质细胞和视网膜色素上皮则通过乳酸穿梭、抗氧化缓冲和营养物回收提供关键的代谢支持。已有研究表明，视网膜能量代谢受神经活动动态调节，闪烁光刺激可诱导耗氧量和代谢通量的快速增加，凸显了视网膜功能与代谢需求之间的紧密耦合。此外，代谢被认为是视网膜发育和功能的关键决定因素，包括年龄依赖性的糖酵解、三羧酸循环、氨基酸代谢和氧化还原通路重塑，以及器官特异性和发育调控的代谢特征，均提示代谢同一性是组织成熟的定义性特征而非分化的次要结果。
尽管多能干细胞来源的视网膜类器官已成为研究视网膜发育和疾病机制的有力模型系统，具备可大规模生成、平行实验、可重复性高和减少动物使用等实验优势，但它们在多大程度上重现天然视网膜的代谢景观仍 largely 未知。在RNA水平上，bulk转录组数据显示视网膜类器官复现了视网膜发育、光感受器分化和突触信号传导的关键基因表达程序，但其代谢相关基因表达与天然视网膜存在部分差异；且大多数主要视网膜细胞类别在类器官中存在，但其分子身份常对应于更早的发育阶段。仅依靠转录组和蛋白质组分析无法捕捉真实的代谢物丰度或通路通量，因此不能直接反映视网膜类器官的功能代谢状态。鉴于视网膜对葡萄糖、脂质和氨基酸代谢的严格依赖，间接分子读数可能忽略影响类器官成熟的关键代谢缺陷。本研究采用小鼠视网膜类器官（MROs）作为高效模型，其分化时间（约28天）短于人类视网膜类器官（约200天），且成本效益更高，并符合3R原则（减少、替代、优化）。研究旨在系统比较干细胞来源的MROs与天然小鼠视网膜的代谢景观，通过将显著差异代谢物映射至典型代谢通路，以确定可能指导未来培养优化和实验调控的候选代谢过程。
研究人员开展了以下工作：从ESD3小鼠胚胎干细胞系分化MROs，于分化第28天收集类器官；同时取出生后第3天（P3）的C57BL/6小鼠视网膜。每组三个独立生物学重复，类器官来自三个独立分化批次以减少批次变异。对细胞内代谢物进行非靶向气相色谱-电子电离-四极杆质谱（GC-EI-Q-MS）代谢组学分析，并对类器官成熟过程中（第8天至第28天）的条件培养基进行时序分析。同时通过定量实时PCR（qPCR）和免疫荧光染色对类器官进行细胞类型特征鉴定。数据处理使用AMDIS进行峰解卷积，基于NIST14质谱库进行注释，以相似性评分≥800保留高置信度代谢物。统计分析采用MetaboAnalyst 6.0进行中位数归一化、缺失值填补、log10转换和自动缩放，以FDR<0.05且倍数变化≥10或≤0.1为显著差异；使用非配对t检验（Benjamini-Hochberg FDR校正）比较视网膜与类器官，使用单因素方差分析（Fisher's LSD事后检验）分析条件培养基时序数据。通路分析将代谢物对应KEGG化合物标识符并提交至MetaboAnalyst进行通路拓扑分析。
研究结果如下：
（1）MROs的特征及色谱图：MROs经逐步分化方案生成，复现囊胚体形成、视泡出现、视杯形态发生和视网膜成熟等主要阶段。总离子色谱图显示MROs与小鼠视网膜的代谢谱大体相似，保留时间对齐，表明核心视网膜代谢特征得到保留。qPCR证实PAX6（视网膜祖细胞标志物）、OPN1SW（视锥光感受器标志物）和Prkca（双极细胞标志物）表达较未分化mESCs显著升高。免疫荧光检测到ARR3（视锥光感受器）、CRX（光感受器谱系）、NRL（视杆光感受器）、谷氨酰胺合成酶（Müller胶质细胞）、CALBINDIN（水平细胞）和PROX1（视网膜中间神经元）等标志物，表明多种视网膜细胞类型的存在。
（2）小鼠视网膜和视网膜类器官中代谢物的分类：共检测到166种注释代谢物，其中148种为两类样本共有；15种仅在小鼠视网膜中检测到，3种仅在MROs中检测到。氨基酸及相关衍生物是两类样本中最大的代谢物类别，其次为碳水化合物/糖醇和脂质相关代谢物；有机酸（包括糖酵解和TCA循环相关代谢物）也在两类样本中被检测到。总体分布显示MROs与天然小鼠视网膜存在广泛的代谢重叠。
（3）MROs中代谢物的无监督和有监督聚类：主成分分析（PCA）显示组织与培养基样本间清晰分离，PC1解释44.7%方差，PC2解释15.3%。层次聚类分析确认了组特异性聚集，生物学重复紧密聚类。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）进一步显示MROs与小鼠视网膜的明确分离。变量重要性投影（VIP）分析显示泛酸、赤藓糖醇、磷酸盐、甘油-3-磷酸和碳水化合物相关代谢物对组间区分贡献较大。PLS-DA双图标示朝向视网膜簇的代谢物包括尿素、赤藓糖醇、磷酸乙醇胺和焦谷氨酸，朝向类器官簇的代谢物包括呋喃果糖、吡喃半乳糖和1-O-甲基吡喃半乳糖苷。模式相关分析在148种代谢物中鉴定出28种显著相关（FDR调整<0.005），包括19种正相关和9种负相关代谢物。
（4）MROs的差异代谢物丰度模式：热图分析显示氨基酸、有机酸、碳水化合物、脂质和磷酸盐相关代谢物在两类样本间形成不同聚类。氨基酸和神经递质相关代谢物（如谷氨酰胺、牛磺酸、亚牛磺酸和谷氨酸相关代谢物）在小鼠视网膜中总体丰度更高，而部分氨基酸衍生物在MROs中相对富集。糖酵解中间体在MROs中丰度降低，磷酸化碳水化合物中间体（如葡萄糖-6-磷酸）也低于小鼠视网膜。碳水化合物谱显示MROs中多种单糖和修饰糖丰度升高。通路分析鉴定出精氨酸生物合成、淀粉和蔗糖代谢、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢以及牛磺酸/亚牛磺酸代谢的显著改变。与天然视网膜相比，MROs中糖酵解、磷酸戊糖途径、TCA循环以及谷氨酰胺/GABA代谢相关代谢物水平降低。
（5）MRO发育过程中条件培养基的代谢物谱：条件培养基GCMS分析显示，第8天至第28天期间细胞外代谢物组成存在时序变化。多变量分析显示早期（第8-10天）、中期（第13-15天）和晚期（第28天）样本形成明显分组。层次聚类热图揭示氨基酸、有机酸、碳水化合物、脂质、烃类和磷酸盐相关代谢物在类器官成熟过程中的阶段特异性重塑，其中多种氨基酸相关代谢物在后期丰度增加，有机酸谱显示显著的时间聚类，中心碳和碳水化合物相关代谢物在后期出现丰度差异，脂质和烃类变化相对温和，甘油和磷酸盐相关代谢物表现出明显波动。
讨论部分总结：本研究表明MROs保留了天然小鼠视网膜的实质性代谢特征，但在糖酵解、磷酸戊糖途径、磷脂代谢和神经递质相关代谢方面存在选择性差异。保守代谢物包括神经递质相关化合物（谷氨酸、γ-氨基丁酸、牛磺酸）、氨基酸（谷氨酰胺、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸）和TCA循环中间体（柠檬酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸），表明类器官形成了视网膜样生化特性。差异代谢物如葡萄糖-6-磷酸、甘油-3-磷酸、磷酸二羟丙酮、核酮糖-5-磷酸、磷酸乙醇胺和肌醇在天然视网膜中可检测但在MROs中低于检测限，提示中枢碳代谢和膜相关代谢通路的分歧。培养基分析显示的时序变化与发育中视网膜组织主动消耗谷氨酸和天冬氨酸的已知模式一致，支持视网膜代谢生态系统的概念。研究还讨论了局限性：类器官成熟可能与体内发育不完全线性等效；GC-MS测量的是相对丰度而非代谢通量；对复杂脂质、类视黄醇和低丰度信号分子灵敏度有限；仅单时间点的细胞内比较；条件培养基变化可能同时受类器官成熟和培养条件（N2、B27、视黄酸、牛磺酸补充）的影响；生物学重复数较少限制统计功效；类器官缺乏视网膜色素上皮相互作用和血管相关营养交换。未来需结合代谢组学与转录组学、同位素示踪和功能分析，并通过优化营养组成、氧供应、长期培养、视网膜色素上皮共培养等策略提高代谢保真度和光感受器成熟度。
研究结论：MROs呈现与小鼠视网膜高度相似的视网膜代谢特征，同时表现出选择性代谢差异。糖酵解、TCA循环、脂质和神经递质相关代谢物丰度的改变表明当前体外培养条件下存在代谢成熟不完全。然而，MROs与天然视网膜之间的实质性重叠支持MROs作为视网膜样代谢系统的有效性。识别这些代谢差异为旨在改善视网膜类器官成熟度和功能保真度的未来优化策略提供了框架。
