《Veterinary Research Communications》：Concurrent fibrinogen Aα-chain amyloidosis and AA amyloidosis in a Humboldt penguin (Spheniscus humboldti)
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淀粉样变（amyloidosis）是一类以异常折叠蛋白以淀粉样纤维形式沉积于组织为特征的疾病，可见于多种哺乳动物和鸟类。在某些情况下，来源于两种不同前体蛋白的淀粉样物质可共存于同一个体，这一状况被称为双重淀粉样变（double amyloidosis）。AA淀
淀粉样变（amyloidosis）是一类以异常折叠蛋白以淀粉样纤维形式沉积于组织为特征的疾病，可见于多种哺乳动物和鸟类。在某些情况下，来源于两种不同前体蛋白的淀粉样物质可共存于同一个体，这一状况被称为双重淀粉样变（double amyloidosis）。AA淀粉样变（amyloid A amyloidosis）已知在鸟类中频繁发生；然而，关于其他类型淀粉样变的信息仍然有限。在本研究中，研究人员报道了一例涉及两种不同类型淀粉样物质并存的洪堡企鹅淀粉样变病例。组织病理学检查、透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）、基于质谱的蛋白质组学分析以及免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）揭示了纤维蛋白原Aα链（fibrinogen Aα-chain, FibA）淀粉样变与AA淀粉样变的并发存在。FibA来源与AA来源的淀粉样沉积分别表现出独特的结节状和弥漫性形态，提示其沉积模式可能为区分这两种类型淀粉样物质提供形态学线索。据研究人员所知，这是企鹅中FibA淀粉样变的首例报道，也是鸟类中两种不同类型系统性淀粉样变并发存在的首次报道。
一、研究背景与科学问题
淀粉样变（amyloidosis）是一类以错误折叠蛋白以淀粉样纤维形式沉积于组织为特征的疾病，在人类中已知约42种类型，在动物中约20种，具体取决于前体蛋白的种类。根据沉积部位与前体蛋白产生位点的关系，淀粉样变可分为系统性和局部性两类。在鸟类中，源于血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A, SAA）并与慢性炎症相关的AA淀粉样变是最常见的系统性淀粉样变类型。然而，鸟类中除AA型以外的其他淀粉样变亚型报道极少，目前仅有蓝翅笑翠鸟的系统性纤维蛋白原Aα链（fibrinogen Aα-chain, FibA）淀粉样变，以及火烈鸟、大斑啄木鸟和三种鹰类的脑部Aβ淀粉样变等零星报道。在企鹅中，虽曾报道过非洲企鹅的系统性淀粉样变，但淀粉样前体蛋白类型及潜在易感因素均未明确。
双重淀粉样变是指同一体内同时沉积来源于两种不同蛋白的淀粉样物质，在人类中偶有发生，但在动物中相关报道极为有限。鸟类中虽曾报道过火烈鸟脑部Aβ淀粉样变与系统性AA淀粉样变的共存，但两种不同类型系统性淀粉样变在同一鸟类个体中同时发生的情况此前从未被报道。FibA淀粉样变在哺乳动物中已见于人类、日本松鼠、犬和日本貉，但在鸟类中仅有一例蓝翅笑翠鸟的报道，其确切发病机制仍不清楚。基于上述研究空白，本研究旨在报道一例洪堡企鹅中FibA淀粉样变与AA淀粉样变并存的双重系统性淀粉样变病例。
二、研究内容与主要结论
研究人员对一只31岁雄性洪堡企鹅进行了尸检。该企鹅在死亡前一年内出现约六个月的跛行，临床上怀疑为关节炎或痛风，并按需给予美洛昔康治疗。死亡前九天出现厌食，尽管给予辅助喂养和皮下液体治疗仍于九天后死亡。尸检发现体腔浆膜和气囊存在白色结节。组织病理学检查显示气囊白色结节区域存在广泛凝固性坏死，内含大量真菌菌丝，周围组织以异嗜性粒细胞、多核巨细胞和纤维蛋白沉积为主的炎性浸润，菌丝经PAS染色阳性，并经免疫组织化学确认为曲霉属（Aspergillus spp.）。此外，多个器官可见嗜酸性无定形沉积物，呈现弥漫性和结节状两种截然不同的形态。肝脏窦周隙见大量弥漫性沉积，血管壁周围见中等量结节状至球状沉积；脾脏红 pulp 和血管壁见大量弥漫性沉积，白 pulp 血管周围见大量结节状沉积；肾脏间质和血管壁见中等量弥漫性沉积；心脏心肌间质和血管壁见中等量弥漫性沉积，血管周围另见中等量结节状沉积；肺间质仅见少量小结节状沉积；食管和肠道固有层见中等量弥漫性沉积；气管黏膜下层见轻度弥漫性沉积。所有沉积物均被刚果红染为粉红色并在偏振光下呈现典型淀粉样双折射。肝脏、脾脏和心脏中的结节状淀粉样沉积物PAS反应阳性，而Alcian blue（pH 1.0和2.5）染色均为阴性。
三、关键技术方法
研究人员使用了以下主要技术方法：（1）组织病理学检查，包括苏木精-伊红染色、刚果红染色及偏振光显微镜检查、PAS反应和Alcian blue染色；（2）透射电子显微镜（TEM），用于观察淀粉样纤维的超微结构；（3）基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的蛋白质组学分析，对肝脏、脾脏和心脏中分别分离的结节状和弥漫性淀粉样沉积物进行前体蛋白鉴定，数据库检索使用洪堡企鹅基因组预测蛋白序列；（4）免疫组织化学（IHC），使用自制的抗FibA抗体和抗SAA抗体对淀粉样沉积物进行特异性标记；（5）生物信息学分析，包括BLAST序列比对、AlphaFold3结构预测和InterPro结构域预测。样本来源为一例圈养洪堡企鹅的尸检组织样本。
四、研究结果
双重淀粉样变的鉴定与形态学区分。 LC-MS/MS蛋白质组学分析显示，弥漫性淀粉样沉积物中SAA为主要的淀粉样成分，而结节状淀粉样沉积物中FibA为最频繁检出的蛋白，两种前体蛋白从未在同一沉积物中被同时检出。免疫组织化学进一步证实，结节状淀粉样沉积物特异性标记FibA抗体，弥漫性淀粉样沉积物特异性标记SAA抗体，两者无共定位。透射电子显微镜显示结节状淀粉样沉积物含直径约13 nm的直而无分支的纤维，呈密集束状排列。据此，该企鹅被确诊为FibA来源和SAA来源淀粉样物质并发沉积的系统性双重淀粉样变，同时伴有含菌丝坏死性肉芽肿性气囊炎。
FibA淀粉样形成区域的鉴定。 对LC-MS/MS数据的再分析显示，FibA来源淀粉样中频繁检出源自全长FibA的αC区（Ser224–Arg378）的肽段。AlphaFold3结构预测提示该区域部分肽段可形成β-折叠结构，InterPro结构域预测表明该区域属于αC结构域。多序列比对显示，企鹅FibA的αC-connector较哺乳动物为短，且淀粉样中检出的肽段部分对应αC-connector但主要对应αC-domain。与蓝翅笑翠鸟中仅检出对应αC-connector的Ala230–Arg283区域相比，企鹅的推定淀粉样形成区在C端延伸范围上存在种间差异。
FibA淀粉样沉积的器官分布特征。 与人类、日本松鼠、犬、日本貉和蓝翅笑翠鸟中FibA淀粉样主要沉积于肾小球和小心脏血管不同，本病例中肾脏未见FibA来源淀粉样沉积，而肝脏和脾脏的沉积也非这些物种中的典型分布模式，提示即使淀粉样来源于FibA的相同αC区，主要沉积部位也可能存在种间差异。
五、讨论与结论
讨论部分指出，FibA来源淀粉样在肝脏、脾脏和心脏血管周围呈结节状沉积，与AA淀粉样弥漫性沉积模式截然不同，这一形态学差异可能为区分两种淀粉样类型提供线索，但需更多病例验证。部分FibA淀粉样沉积呈球状形态且PAS阳性，类似corpora amylacea，但经刚果红染色和TEM确认为淀粉样，PAS阳性提示沉积物内或其周围存在含碳水化合物成分，其生化性质尚不清楚。关于FibA淀粉样形成区，本病例中αC区（Ser224–Arg378）的频繁检出提示企鹅FibA淀粉样纤维的主要构成序列跨越αC-connector和αC-domain两个区域，与蓝翅笑翠鸟中主要对应αC-connector的序列存在C端延伸差异，αC区的序列变异可能导致了FibA淀粉样形成序列的种间特异性差异。方法学方面，由于洪堡企鹅基因组中初始注释的FibA序列不完整，研究人员以近缘物种帝企鹅的FibA序列为参考进行了参考引导的序列重建，重建序列与后续提交至公共数据库的洪堡企鹅FibA序列（NCBI accession: KAM6266820）100%一致，验证了序列预测的准确性，同时也凸显了非模式物种自动蛋白注释的局限性。AA淀粉样变方面，本病例存在的坏死性肉芽肿性气囊炎提示曲霉感染可能与SAA水平升高和AA沉积相关。FibA作为阳性急性期蛋白，其血浆浓度随炎症升高，提示循环FibA浓度升高可能构成FibA淀粉样变的易感因素。研究人员最后指出，人类中FibA淀粉样变已知存在遗传突变风险因素，企鹅中突变的作用有待未来阐明。
研究结论：研究人员诊断了首例洪堡企鹅FibA淀粉样变，并且据研究人员所知，这是鸟类中首例涉及两种淀粉样亚型的系统性双重淀粉样变报道。
