《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》：In vitro propagation, genetic evaluation and slow-growth storage of the endemic and endangered species Amygdalus ledebouriana
编辑推荐：
基于生物技术的保护策略可为哈萨克斯坦红皮书和世界自然保护联盟（IUCN）红色名录中收录的特有濒危物种野扁桃（Amygdalus ledebouriana）的生物多样性保护和可持续生态系统管理提供支持。这一研究不足的物种分布于哈萨克斯坦东部，即西南阿尔泰山、塔尔
基于生物技术的保护策略可为哈萨克斯坦红皮书和世界自然保护联盟（IUCN）红色名录中收录的特有濒危物种野扁桃（Amygdalus ledebouriana）的生物多样性保护和可持续生态系统管理提供支持。这一研究不足的物种分布于哈萨克斯坦东部，即西南阿尔泰山、塔尔巴哈台山和准噶尔阿拉套山的山麓地带，这些区域正受到过度放牧、春秋季焚烧、采花和水分亏缺的不利影响。该物种可用作砧木以培育李树和桃树（赋予抗旱性），也可用于扁桃育种，同时还用于土壤保护。研究人员利用植物生长调节剂meta-topolin（1.0 mg L?1）、赤霉酸（GA3）（1.0 mg L?1）和吲哚-3-丁酸（IBA）（0.01 mg L?1）建立了一套高效的微繁方案，每外植体可产生4.96个微枝。通过在黑暗条件下将枝条在半强度Quoirin and Lepoivre（QL）培养基（添加1.0 mg L?1 IBA）中预培养10天，随后转移至无激素的半强度QL培养基，实现了高效离体生根，每外植体产生4.2条根（生根率68%）。在低温（4 °C）黑暗条件下，使用含2.0 g L?1脱落酸（ABA）或1.5%蔗糖的QL培养基可实现枝条的缓慢生长保存；该方法可在不继代培养的情况下抑制微枝生长并维持高达100%的植株活力长达四个月。利用8个简单序列重复（SSR）标记进行的分子遗传学分析证实了再生植株与母株的完全一致性，证明了其遗传稳定性。本研究开发的微繁和缓慢生长保存方案可作为该特有濒危物种迁地保护的有力工具。
研究背景
生物多样性保护是人类维护健康、繁荣与安全的战略投资。在哈萨克斯坦，约14%的植物物种为特有种，其中许多处于稀有或濒危状态。野扁桃（Amygdalus ledebouriana）被列入哈萨克斯坦红皮书和世界自然保护联盟（IUCN）红色名录，是一种研究不足的特有濒危落叶灌木，属于蔷薇科（Rosaceae）。该物种分布于哈萨克斯坦东部的西南阿尔泰山、塔尔巴哈台山和准噶尔阿拉套山山麓地带，在中国新疆维吾尔自治区也有分布。该种群受到过度放牧、春秋季焚烧、采花和水分亏缺的严重威胁。野扁桃不仅具有观赏价值（亮粉色花朵），还可用作李树和桃树的抗旱砧木、扁桃育种材料、土壤保护植物，并在中国被用于提取天然苯甲醛（精油原料）。由于就地保护无法完全保障特有种的存续，必须实施迁地保护措施。生物技术手段，特别是离体微繁和缓慢生长保存策略，为珍稀濒危植物的保护提供了新途径。然而，此前针对野扁桃的生物技术开发研究十分有限，缺乏整合微繁、生根和缓慢生长保存的综合方案。因此，本研究的目的是开发一套有效的离体保存方案，通过研究不同植物生长调节剂对离体繁殖、生根和缓慢生长保存阶段的影响，并建立基于该方案的野扁桃离体种质资源库。
研究方法
研究人员从哈萨克斯坦阿拜州乌尔贾尔区的塔尔巴哈台国家自然公园采集了两株母株的一年生枝条，获得许可后，以其腋芽作为外植体建立离体培养体系。采用的主要关键技术方法包括：（1）分子鉴定：利用叶绿体rbcL和trnH-psbA标记及核ITS标记进行物种分子鉴定，并将核苷酸序列提交至美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库；（2）微繁优化：在Quoirin and Lepoivre（QL）培养基上测试不同浓度组合的植物生长调节剂——6-苄氨基嘌呤（BAP）、meta-topolin（mT）、赤霉酸（GA3）和吲哚-3-丁酸（IBA）对茎芽增殖的影响；（3）生根诱导：比较不同光照条件（暗预培养10天vs持续光周期）和不同IBA浓度（0-2.5 mg L?1）在半强度QL培养基上的生根效果；（4）缓慢生长保存：在低温（4 °C）黑暗和常温（24-26 °C）光周期两种条件下，测试脱落酸（ABA）、矮壮素（CCC）、甘露醇和不同浓度蔗糖对枝条生长的抑制效果和存活率影响；（5）遗传稳定性评估：利用8个简单序列重复（SSR）标记比较两个群体共10个离体再生植株与其对应母株的等位基因图谱。
研究结果
1. 植物材料的采集与鉴定
研究人员从塔尔巴哈台国家自然公园采集了两株母株的一年生枝条，制作了标本（登记号NUR08564）并存放在阿斯塔纳植物园标本馆。通过rbcL、trnH-psbA和ITS三个分子标记成功扩增并测序，获得了各标记在NCBI数据库中的唯一登录号。序列长度因标记而异：rbcL为450-492 bp，trnH-psbA为348-350 bp，ITS为335-454 bp；鸟嘌呤和胞嘧啶（GC）含量分别为43.2-43.3%、36.7-36.8%和71.0-71.7%。BLAST比对确认了所有样品的分类学归属。
2. 离体培养的建立
采用前期优化的9%过氧化氢（H2O2）处理5分钟的灭菌方案，所有外植体均保持无菌状态，未观察到微生物污染或坏死，100%的外植体成功建立离体培养。
3. 植物生长调节剂对离体繁殖的选择
所有添加植物生长调节剂的处理均显著提高了形态发生活性。处理IV（mT 1.0 mg L?1 + GA3 1.0 mg L?1 + IBA 0.01 mg L?1）产生了最高的茎高增长（0.63 cm）和最多的叶片数（14.43片/外植体），同时获得了3.96个微枝/外植体。处理V（BAP 0.25 mg L?1 + GA3 1.0 mg L?1 + IBA 0.01 mg L?1）获得了最高的微枝数量（4.46个/外植体），但导致茎秆增厚、叶片较小。综合考虑，处理IV被选为最优繁殖培养基。
4. 离体生根培养条件的选择
暗预培养10天的处理中，48%的微枝形成根系；而在持续光周期下未观察到生根。在暗预培养条件下，进一步测试不同IBA浓度发现：1.0 mg L?1 IBA处理表现出最佳生根效果，生根率达68%，平均每外植体形成4.20条根，平均根长1.94 cm。随着IBA浓度升高至2.0和2.5 mg L?1，生根率和根数量均显著下降，表明高浓度IBA抑制了根发生。
5. 缓慢生长保存条件的筛选
在4 °C黑暗条件下培养120天后，添加2.0 g L?1 ABA的处理II和添加1.5%蔗糖的处理VI均有效抑制了茎芽生长（高度增长仅0.04 cm），同时保持了100%的植株活力。添加0.5 mg L?1 CCC和2%甘露醇的处理分别保持了82%和74%的存活率。在常温光周期条件下（24-26 °C），所有处理在长期培养（120天）后均出现黄化、坏死和死亡，无一恢复。因此，低温（4 °C）和黑暗条件是成功抑制野扁桃代谢活动的关键因素，最优保存培养基组成为含2.0 g L?1 ABA或1.5%蔗糖的QL培养基。
6. 基于SSR标记的再生植株遗传稳定性评估
8个SSR引物均获得可重复的扩增产物，共检测到16个等位基因，片段大小为102-290 bp。在两个群体中，所有8个SSR位点（CPDCT023、CPDCT025、RPPG4-084、RPPG1-041a、RPPG1-037a、RPPG6-033、CPDCT005、RPPG2-022）在母株和各自离体再生植株之间均显示出完全一致的等位基因谱，未检测到多态性。此外，CPDCT025位点在两个群体间显示等位基因差异（群体1为189 bp纯合，群体2为189/199 bp杂合），证实该标记面板能够检测遗传变异。
讨论与结论
本研究首次为濒危特有种野扁桃建立了一套完整的离体繁殖和缓慢生长保存方案。在微繁阶段，meta-topolin（mT）相较于6-苄氨基嘌呤（BAP）虽在微枝数量上略低，但能产生更高质量的茎芽（茎更长、叶片发育更好），这与mT在其他植物中减少生理异常的作用一致。在生根阶段，暗预培养结合1.0 mg L?1吲哚-3-丁酸（IBA）是最佳条件，这与吲哚-3-丁酸（IBA）在木本植物离体培养中促进不定根形成的普遍作用相符。在缓慢生长保存方面，低温（4 °C）黑暗环境是实现长期保存的关键，脱落酸（ABA）和低浓度蔗糖均能有效抑制生长并维持高存活率，这为中期迁地保存提供了可行方案。最重要的是，8个简单序列重复（SSR）标记的分析证实了再生植株与母株的遗传完全一致性，证明该微繁方案不会引起体细胞无性系变异，适用于种质资源的保真保存。综上所述，本研究开发的微繁和缓慢生长保存方案可作为野扁桃迁地保护的有效工具，为该特有濒危物种的遗传资源保存和可持续管理提供了重要的技术支持。
