《Advanced Biotechnology》：Spatial multi-omics uncovers an invasive-desmoplastic cellular community with prognostic and therapeutic implications in pancreatic ductal adenocarcinoma
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胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）以致密的促结缔组织增生性间质和显著的空间异质性为特征，然而，调控其肿瘤微环境的多细胞组织原则仍知之甚少。在本研究中，研究人员进行了单细胞RNA测序（single-cel
胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）以致密的促结缔组织增生性间质和显著的空间异质性为特征，然而，调控其肿瘤微环境的多细胞组织原则仍知之甚少。在本研究中，研究人员进行了单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq；n=9）和空间转录组学（spatial transcriptomics；n=4）分析，整合了61,234个单细胞和30,430个空间斑点，鉴定出一种侵袭前沿肌成纤维细胞样癌症相关成纤维细胞（invasive-frontier myofibroblastic cancer-associated fibroblast, IF-myCAF），其特征为ACTA2、TAGLN、COL11A1、THBS2、CTHRC1和POSTN的高表达。IF-myCAF在八个独立的PDAC队列（159个样本，含67,959个CAF）中得到验证，显示出保守的转录程序，并在各数据集中代表主要的CAF亚群。空间细胞群落（cellular community, CC）分析确定了五个复发性CC，它们描绘了PDAC的多细胞组织结构。值得注意的是，定位于肿瘤-间质交界处的侵袭-促结缔组织增生性CC（invasive-desmoplastic CC, ID-CC）以IF-myCAF的5.8倍富集为特征；在该群落内，IF-myCAF与恶性导管细胞和巨噬细胞共定域。研究人员还发现，ID-CC转录特征在TCGA-PAAD中与较差预后独立相关。此外，对4,009对IF-myCAF相关配体-受体（ligand-receptor, LR）对的分析确定IF-myCAF是ID-CC内介导细胞外基质（extracellular matrix, ECM）相关细胞间信号传导的主要细胞群体。针对该群落内介导细胞间通讯的四个IF-myCAF衍生配体-受体轴（THBS2-CD47、CTHRC1-FZD8、PPIA-BSG/CD147、MIF-CD74）进行的基于结构的虚拟筛选，确定了五种多靶点药物重定位候选药物，包括考尼伐坦（conivaptan）、洛那法尼（lonafarnib）、鲁卡帕尼（rucaparib）、地氯雷他定（desloratadine）和酮替芬（ketotifen）。总之，本研究首次鉴定了一个新的CAF亚群IF-myCAF，并建立了基于CC的PDAC空间结构组织方案。研究人员的发现增进了对PDAC中空间生态系统水平间质异质性的理解，并提示靶向ID-CC内IF-myCAF驱动的信号传导具有治疗潜力。
**一、研究背景与科学问题**
胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）是全球最致命的恶性肿瘤之一，五年生存率低于13%。其标志性特征之一是致密的促结缔组织增生性间质，可占肿瘤体积的70%，主要由癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblast, CAF）驱动。先前的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）研究已确立主要CAF亚型，包括肌成纤维细胞样CAF（myofibroblastic CAF, myCAF）、炎症性CAF（inflammatory CAF, iCAF）和抗原呈递CAF（antigen-presenting CAF, apCAF）。然而，一个基本问题仍未解决：这些CAF群体在完整肿瘤组织内如何空间组织，它们形成何种多细胞微环境以执行促肿瘤功能？myCAF在PDAC中的功能作用一直存在激烈争议，既往研究显示其耗竭可加速肿瘤进展，而另一些研究则表明myCAF通过基质纤维化和组织张力促进侵袭、转移和治疗抵抗。近期工作揭示了由表观遗传重编程和MAPK信号梯度驱动的广泛CAF可塑性，提示CAF功能状态受微环境信号动态调控而非固定谱系。这种矛盾可能源于关键的方法学缺陷：单细胞转录组学将细胞从其天然组织结构中解离，丢失了将CAF表型与其精确解剖定位联系起来所必需的空间背景。最近，细胞群落（cellular community, CC）分析框架将分析焦点从单个细胞类型转移到多细胞邻域作为组织功能单元，但尚缺乏对PDAC的系统性CC分析。
**二、研究内容与意义**
针对上述问题，本研究整合了匹配的scRNA-seq和空间转录组学数据，建立了基于CC的PDAC空间结构组织方案。研究人员首先通过单细胞转录组学描绘了PDAC的细胞景观，鉴定出一个新型CAF亚群——侵袭前沿肌成纤维细胞样CAF（invasive-frontier myofibroblastic CAF, IF-myCAF），其特征为同时表达肌成纤维细胞收缩基因（ACTA2、TAGLN）和基质相关基因（COL11A1、THBS2、CTHRC1、POSTN）。随后通过空间转录组学分析确定了五个复发性CC，其中侵袭-促结缔组织增生性CC（invasive-desmoplastic CC, ID-CC）定位于肿瘤-间质交界处，以IF-myCAF的5.8倍富集为特征，并与恶性导管细胞和巨噬细胞共定域。ID-CC转录特征在TCGA-PAAD队列中与较差总生存期显著相关（HR=1.94, 95% CI 1.28-2.94, P=0.0016），且在多变量Cox回归中独立于TNM分期和年龄。进一步的配体-受体（ligand-receptor, LR）分析确定了IF-myCAF作为ID-CC内ECM相关细胞间信号传导的主要细胞群体，并通过基于结构的虚拟筛选鉴定出五种多靶点药物重定位候选药物。本研究首次在空间生态系统水平上揭示了PDAC间质异质性的组织原理，为开发空间信息指导的治疗策略奠定了基础。
**三、关键技术方法**
本研究的主要技术方法包括：（1）单细胞RNA测序（scRNA-seq，n=9）：对5例初治PDAC患者的肿瘤组织和切缘组织配对标本（共9个样本）进行测序，获得61,234个高质量单细胞；（2）空间转录组学（n=4）：使用BaiCreate S1000平台（斑点直径2 μm，亚细胞分辨率超过10× Visium平台）对冷冻OCT包埋组织切片进行测序，获得30,430个空间斑点；（3）基于稳健细胞类型分解（robust cell type decomposition, RCTD）的空间去卷积和细胞群落识别：通过空间邻域平滑、超斑点聚合和多方法共识聚类（k=5，平均配对调整兰德指数ARI=0.75）鉴定五个复发性CC；（4）CellChat配体-受体分析：从scRNA-seq数据中鉴定4,009对IF-myCAF相关LR对；（5）基于结构的虚拟筛选：使用AlphaFold3-Multimer预测蛋白复合物结构，LightDock进行蛋白-蛋白对接，AutoDock Vina对3,000种FDA批准药物进行虚拟筛选。外部验证队列包括八个独立PDAC scRNA-seq数据集（GSE154778、GSE155698等，共159个样本，67,959个CAF）。
**四、研究结果**
**4.1 PDAC配对肿瘤组织和切缘组织的单细胞转录组景观**
通过整合单细胞转录组分析，研究人员从5例初治PDAC患者的配对肿瘤组织和切缘组织中获得了61,234个高质量单细胞，鉴定出12个主要细胞谱系，其中T/NK细胞（43.4%）和CAF（10.5%）是最丰富的组分。细胞类型特异性丰度分析显示，B细胞、中性粒细胞和富含酶的腺泡细胞富集于切缘组织，而导管细胞、神经/胶质细胞、胰腺星状细胞和myCAF主要定位于肿瘤组织。这种不同间质、免疫和上皮亚群在各区室中的协调富集提示PDAC中存在高阶多细胞组织单元。
**4.2 具有独特转录组和形态学特征的亚群揭示新型肌成纤维细胞样CAF**
对CAF进行亚聚类分析鉴定出四种功能不同的亚群：myCAF、ECM-CAF、补体分泌CAF（complement-secreting CAF, csCAF）和新型IF-myCAF。IF-myCAF表现出双重转录程序，同时表达肌成纤维细胞收缩基因（ACTA2、TAGLN）和基质相关基因（COL11A1、THBS2、CTHRC1、POSTN）。拟时间轨迹分析显示IF-myCAF位于肌成纤维细胞分化分支的末端。IF-myCAF、ECM-CAF和myCAF主要从肿瘤组织标本中恢复（分别为94.7%、71.1%和69.8%），而csCAF几乎仅从切缘组织标本中恢复（98.6%）。在八个独立PDAC队列（159个样本，67,959个CAF）的外部验证中，与IF-myCAF对应的群体占所有CAF的48.4%，确立了其作为主要CAF亚群的地位。
**4.3 空间作图揭示组织化肿瘤结构和IF-myCAF-恶性细胞邻近性**
空间转录组学分析揭示了PDAC的主要组织区室，包括免疫球蛋白定义的浆细胞区、POSTN/COL11A1定义的间质区、REG4/VSIG1定义的恶性上皮区等。RCTD去卷积显示恶性导管细胞集中于肿瘤巢内，周围环绕致密的CAF-巨噬细胞间质套。空间梯度分析和元分析广义加性模型（meta-GAM）分析显示IF-myCAF比例在低恶性导管丰度处达到峰值，并向肿瘤中心逐渐下降。最近邻距离分析证实IF-myCAF是与导管细胞物理距离最近的细胞类型。
**4.4 鉴定五个细胞群落定义PDAC多细胞组织**
通过CC识别流程，研究人员鉴定出五个具有不同细胞类型组成的复发性CC：侵袭-促结缔组织增生性CC（ID-CC）、腺泡-实质CC（AP-CC）、免疫-间质CC（IS-CC）、纤维化-间质CC（FS-CC）和间质重塑CC（SR-CC）。ID-CC以IF-myCAF的5.8倍富集为特征，与恶性导管细胞（3.1倍富集）和csCAF（2.8倍富集）共定域。空间自相关分析证实所有样本的Moran's I显著为正（所有P<0.001），验证了CC代表真实的空间连续多细胞单元。
**4.5 功能特化区分ID-CC与其他细胞群落，其转录程序预测不良预后**
GO富集分析确认ID-CC上调基因在细胞-底物黏附、TGF-β应答、ECM组织和胶原纤维组装中过度代表。功能模块评分显示ID-CC在所有CC中表现出最高的侵袭/EMT和ECM重塑活性。在TCGA-PAAD队列（n=177）中，高ID-CC评分与较差总生存期显著相关（HR=1.94, 95% CI 1.28-2.94, log-rank P=0.0016）。多变量Cox回归确认ID-CC是独立于TNM分期和年龄的预后因素（HR=1.92, 95% CI 1.27-2.92, P=0.002）。五个CC中仅ID-CC的95% CI不跨越1.0，表明不良预后与IF-myCAF富集的侵袭性群落转录程序特异性相关。
**4.6 IF-myCAF定义ID-CC的细胞身份和核心调控程序，并主导介导ECM相关细胞间信号**
通过四维优先化策略（分化轨迹基因、差异表达基因、高变基因、共表达网络枢纽基因）鉴定出72个IF-myCAF高置信度核心调控基因，GO富集确认其主要参与ECM组织、胶原纤维组装和结缔组织发育。CellChat分析鉴定出4,009对IF-myCAF相关LR对。作为信号发送者，IF-myCAF以COLLAGEN轴为主导（聚合评分=8.65），其次为LAMININ、FN1和THBS；作为接收者，IF-myCAF主要感知来自ECM-CAF的COLLAGEN信号（聚合评分=4.03），提示存在维持IF-myCAF激活的旁分泌前馈环路。空间分析显示IF-myCAF与巨噬细胞共定域（Spearman r=0.31），与导管细胞占据相邻但不同的空间域（Spearman r=-0.18）。
**4.7 基于结构的药物重定位识别靶向IF-myCAF驱动信号的候选药物**
通过平行证据通道优先选择四个LR对（THBS2-CD47、CTHRC1-FZD8、PPIA-BSG/CD147、MIF-CD74），AlphaFold3-Multimer结构预测和LightDock蛋白-蛋白对接生成了复合物构象。对3,000种FDA批准药物进行虚拟筛选，鉴定出五种具有共识平均结合亲和力≤-11.0 kcal/mol的多靶点候选药物：考尼伐坦（conivaptan，-11.84 kcal/mol）、洛那法尼（lonafarnib，-11.52）、鲁卡帕尼（rucaparib，-11.45）、地氯雷他定（desloratadine，-11.38）和酮替芬（ketotifen，-11.18）。正交验证（高精度重对接、经验零分布基准、偏移口袋对照、诱饵受体对照）确认了筛选结果的稳健性。
**五、讨论总结与结论**
本研究的发现有助于调和关于myCAF促肿瘤与抑肿瘤功能的长期争议。IF-myCAF共表达经典myCAF的收缩程序和ECM-CAF的基质程序，占据肌成纤维细胞分化分支的末端，并集中分布于恶性上皮巢与促结缔组织增生套交界的侵袭前沿。这一定位表明CAF功能不能仅从细胞身份解读：同一广泛的间质谱系可能根据其多细胞环境承担相反的角色。在生态系统水平上，基于CC的组织模式与胶质母细胞瘤和泛癌空间分析的最新发现相呼应，支持复发性多细胞群落构成肿瘤结构功能单元的观点。值得注意的是，ID-CC是唯一在TCGA-PAAD中独立预测生存的CC特征，表明预后信息存在于侵袭-促结缔组织增生生态位的特定组成中，而非间质丰度本身——这是传统H&E-based肿瘤-间质比评估无法捕获的区分。
研究结论：本研究首次鉴定了一个新的CAF亚群IF-myCAF，并建立了基于CC的PDAC空间组织结构方案。IF-myCAF以ACTA2、TAGLN、COL11A1、THBS2、POSTN和CTHRC1的高表达为特征，代表PDAC数据集中的主要CAF亚群。值得注意的是，IF-myCAF定义了一个称为ID-CC的侵袭-促结缔组织增生性群落，该群落代表了与PDAC进展相关的功能特化生态位，其转录特征与不良预后独立相关。研究人员进一步发现，ID-CC内IF-myCAF衍生的信号轴可能被现有已批准药物靶向。总之，这些发现将PDAC间质异质性的理解从单细胞目录推进到空间生态系统水平组织，并为空间信息指导的治疗策略提供了基础。
