《Archives of Microbiology》：Eco-phenotypic characterization of Candida palmioleophila from poultry litter and marine environments: implications for One Health
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Candida palmioleophila是一种新兴的机会致病酵母，常被误鉴定为Meyerozyma guilliermondii复合群中的成员，这可能掩盖其临床与生态学意义。尽管其临床重要性日益被认识，但环境分离株的表型特征仍鲜有研究。本研究评估了分离自两
Candida palmioleophila是一种新兴的机会致病酵母，常被误鉴定为Meyerozyma guilliermondii复合群中的成员，这可能掩盖其临床与生态学意义。尽管其临床重要性日益被认识，但环境分离株的表型特征仍鲜有研究。本研究评估了分离自两种受人为影响环境来源——家禽垫料（n=6）与城市化海岸环境（n=8）——的14株C. palmioleophila的生态表型谱。抗真菌药敏试验显示，所有受试分离株的氟康唑最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）均较高（32至>128 μg/mL），而两性霉素B、卡泊芬净和阿尼芬净的MIC范围分别为1至2 μg/mL、0.25至1 μg/mL和0.06至0.5 μg/mL。在测试条件下，未观察到抗真菌MIC变化与生物膜生物量之间存在可检测的关联。这些分离株表现出广泛的生理耐受性，包括在高达40 °C的温度下生长、耐受高浓度NaCl和细胞壁应激，以及细胞壁几丁质含量和细胞内脂质体积累的变异。毒力相关表型包括生物膜形成、大多数分离株的高细胞表面疏水性、广泛的酯酶活性、可变的磷脂酶活性以及有限的蛋白酶活性。综上所述，这些发现扩展了目前对C. palmioleophila环境表型库的认识，并支持开展更广泛的环境、临床和基因组监测，以阐明其生态学、种群结构和潜在传播途径。
**研究背景**
Candida palmioleophila是一种新兴的非白念珠菌（non-albicans Candida，NAC）物种，由于与Meyerozyma guilliermondii复合群成员在生化表型上高度重叠，商业鉴定系统如Vitek2和API 20C常将其误鉴定为其他菌种，导致其临床与生态学意义长期被低估。近年来，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和rDNA测序等技术的应用显著提高了该物种的鉴定准确性。临床上，该菌已被报道引起儿童念珠菌血症、全身性感染及内源性眼内炎等侵袭性疾病，且临床分离株呈现氟康唑MIC升高趋势。环境方面，该菌已在巴西的污水、绿海龟（Chelonia mydas）以及商业鱼类等多种生态位中被检出，显示出广泛的生态分布。然而，环境分离株的毒力相关表型（如生物膜形成、水解酶活性、细胞表面特性等）和生理耐受特征仍缺乏系统研究，这限制了对该物种生态适应性和潜在传播路径的理解。从One Health角度出发，系统评估环境来源菌株的生态表型特征对临床监测和生态风险评估具有重要意义，因此开展了本研究。
**研究内容与意义**
研究人员对分离自巴西里约热内卢州两家家禽养殖场（BF1、BF2）的6株家禽垫料分离株（CP1、CP2、CP3、CP4、CP6、CP7）和两处城市化海滩（Icaraí、Jurujuba）的8株海洋分离株（I4、J13、J19、J20、J27、J30、J36、J37）进行了系统的生态表型分析，评价了抗真菌药敏、热耐受、应激反应、生物膜形成、细胞表面特性、水解酶活性及细胞壁几丁质/脂质体等结构代谢表型。研究发现所有分离株均具有高氟康唑MIC、广泛的生理耐受性和多样化的毒力相关表型，且MIC变异与生物膜生物量之间无显著关联。这些发现扩展了该物种环境表型库的认知，支持在One Health框架下将环境分离株纳入更广泛的监测体系。
**关键技术方法**
样本来自巴西里约热内卢州两处家禽养殖场和两处城市化海滩（Icaraí、Jurujuba），菌种经MALDI-TOF MS和ITS/D1/D2测序确认。方法包括：CLSI肉汤微量稀释法测MIC；琼脂平板法测磷脂酶/酯酶/蛋白酶活性；96孔板染色法评估生物膜生物量和胞外基质；水-辛烷两相法测细胞表面疏水性（cell surface hydrophobicity，CSH）；Zeta电位仪测表面电荷；流式细胞术定量细胞壁几丁质和脂质体；梯度点样法分析应激耐受；Gamma广义线性模型（Generalized Linear Model，GLM）和估计边际均值（Estimated Marginal Means，EMMs）进行统计关联分析。
**研究结果**
**热耐受与生长动力学：**通过96孔板生长曲线监测发现，所有分离株在25°C、37°C和40°C均可生长；40°C时前24小时出现明显延滞期，随后48至72小时增长显著，提示分离株间存在温度依赖的生长动力学差异。
**抗真菌药敏谱：**CLSI肉汤微量稀释法测定显示，所有分离株氟康唑MIC为32至>128 μg/mL，MIC50和MIC90分别为128和>128 μg/mL；两性霉素B MIC为1至2 μg/mL，其中CP1、CP2、CP7和J27为2 μg/mL；卡泊芬净MIC为0.25至1 μg/mL；阿尼芬净MIC为0.06至0.5 μg/mL。由于缺乏物种特异性折点，结果以定量MIC分布呈现。
**三维抗真菌MIC图谱：**对非唑类MIC进行log
2变换后绘制三维分布图，发现大多数分离株在卡泊芬净和阿尼芬净MIC范围内紧密聚集，分布变异主要由两性霉素B MIC差异（1 vs 2 μg/mL）驱动。
**水解酶活性：**琼脂平板法检测表明，酯酶活性分布最广，13/14（92.9%）分离株为优秀生产株（Pz<0.399）；磷脂酶活性可变，CP3、CP4、CP7为非生产株，J19为优秀生产株；蛋白酶活性罕见，仅CP4为优秀生产株（Pz=0.3）。
**生物膜形成与胞外基质相关染色：**所有分离株在25°C和37°C均可在聚苯乙烯表面形成可测量生物膜；37°C下海洋分离株J37生物膜生物量最高，但其番红染色的胞外基质信号相对其生物量较低。
**细胞表面疏水性（CSH）：**水-辛烷两相法结果显示，大多数分离株CSH超过80%，属高疏水性；海洋分离株J37约为35%，属中等疏水性，为独特的低疏水表型。
**细胞表面电荷（Zeta电位）评估：**Zeta电位测定显示，CP1至CP4的电位值最负（-21.07至-24.73 mV），而其余分离株（包括CP6、CP7及所有海洋分离株）接近中性（-2.15至+2.93 mV），表明细胞表面静电性质存在显著株间差异。
**细胞壁几丁质含量与细胞内脂质体积累：**流式细胞术定量显示，细胞壁几丁质平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）多在20,000至30,000 a.u.之间，其中海洋分离株J20和J30较高（J20超过40,000 a.u.）；细胞内脂质体MFI在CP3、CP4、J20和J30中超过3,000 a.u.，提示两类表型均存在株间异质性。
**梯度应激耐受分析：**点样法显示所有分离株在1.0和1.5 M NaCl条件下维持生长，2.0 M NaCl时菌落生长减弱但仍有可检测生长；100 μg/mL刚果红条件下生长不受明显抑制；0.02% SDS可生长、0.04%显著受抑、0.06%受抑制；咖啡因呈浓度依赖性抑制，20和30 mM时抑制作用更强，尤以CP6为著。
**检测表型性状间的统计关联：**通过Gamma GLM和EMMs分析，未检测到氟康唑MIC分类与25°C下生物膜生物量之间的显著关联，两性霉素B MIC与生物膜生物量之间亦无显著关联，磷脂酶活性在两环境来源间无统计学差异。
**总结与讨论**
讨论部分指出，所有环境分离株均呈现高氟康唑MIC，但由于未定量环境中的抗真菌化合物、农用化学品等污染物，且未设置较少人为影响对照位点，无法判断该表型源于局部环境选择还是物种内在特性。所有分离株可在37°C和40°C生长，表明该物种具有较强热耐受，但并不能直接证明其对禽类或人类宿主的适应性。分离株对高盐和刚果红表现出耐受，但对SDS和咖啡因敏感，且实验未建立应激耐受与MIC变异之间的机制联系。几丁质和脂质体含量变化被解释为表型多样性，而非特定适应机制。生物膜和CSH虽与表面相互作用相关，但未独立量化黏附能力；水解酶活性的体外检测亦不能视为直接致病性证据。Zeta电位变异的生物学后果未被直接评估。统计模型未发现MIC与生物膜之间的关联，但该结果局限于所测表型，不应推断为无适合度代价。生态学上，从家禽垫料和海洋环境分离该菌验证了其生态分布广度，但当前研究设计不能将这些环境定义为流行病学储库。One Health框架下，本研究支持将环境来源纳入临床相关酵母菌监测，但未确立环境、动物与人类之间的传播链条。研究局限性包括样本量小、未评估环境流行率、未测污染物浓度、未进行菌株水平遗传分析以及体外表型不直接等同于体内毒力等。
**结论**：总之，本研究证明了来自家禽垫料和城市化海岸环境的环境Candida palmioleophila分离株具有显著的表型多样性。这些分离株表现出高氟康唑MIC、多种应激条件下的生长能力、高达40°C的热耐受性、生物膜形成、以高细胞表面疏水性为主，以及可变的毒力相关酶活性、细胞壁几丁质含量、细胞内脂质体积累和细胞表面电荷。这些发现共同扩展了目前对这一研究不足的酵母菌环境表型库的认识。重要的是，本研究并未证明所调查的环境会选择抗真菌耐药性、构成流行病学储库或介导向人类或动物的传播。同样，本文所描述的表型不应被解释为毒力或宿主适应的直接证据。需要在更广泛的环境和临床采样基础上，结合基因组学特征分析和功能研究，以确定C. palmioleophila的种群结构、环境持久性、潜在选择压力、致病潜力和传播途径。在One Health框架内，这些发现支持将环境分离株纳入今后对该新兴酵母的生态学和抗真菌药敏研究。
