《Archives of Microbiology》：Tolerance to heavy metals of bacteria from Brazilian deep aquatic environments
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细菌对重金属（HM）的耐受性对生态系统和人类健康构成重大风险。本研究评估了来自巴西南部两个深层水生环境的24株细菌分离株对HM的耐受性：瓜拉尼含水层系统（GAS）和里奥格兰德锥（RGC）。GAS水井位于农业活动密集区域，其中铁、硒和铝的水位超过监管限值。RGC
细菌对重金属（HM）的耐受性对生态系统和人类健康构成重大风险。本研究评估了来自巴西南部两个深层水生环境的24株细菌分离株对HM的耐受性：瓜拉尼含水层系统（GAS）和里奥格兰德锥（RGC）。GAS水井位于农业活动密集区域，其中铁、硒和铝的水位超过监管限值。RGC是一个被认为是原始的深海环境，尽管存在人类影响的证据。研究人员对芽孢杆菌属（Bacillus）、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）和类芽孢杆菌属（Paenibacillus）分离株进行了HM最低抑菌浓度（MIC）测试、生物膜形成试验、扫描电子显微镜（SEM）观察和金属相关基因分析。58%的GAS分离株对七水合硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）表现出更高的耐受性，75%对十二水合硫酸铝铵（NH4Al(SO4)2·12H2O）表现出更高的耐受性，67%对亚硒酸钠（Na2SeO3）表现出更高的耐受性，均高于参考对照菌株（RSs）。RGC分离株在低浓度下对乙酸汞（(CH3COO)2Hg）具有耐受性，但在二水合氯化铜（CuCl2·2H2O）和六水合氯化镍（NiCl2·6H2O）耐受性方面与RSs相当。GAS分离株在暴露于亚硒酸钠24小时后表现出强烈的生物膜形成，而RGC分离株在乙酸汞处理下表现出较弱的生物膜。SEM揭示了GAS分离株中潜在的硒纳米颗粒和形态学改变，同时在海洋细菌中检测到具有高汞含量的外部颗粒。每个环境中有三株分离株携带与硒掺入或汞还原相关的基因。结果表明，HM可能干扰这些生态系统微生物群落的结构和动力学，凸显了这些来自未充分探索（尽管已受影响）水生环境的微生物表型特征作为水污染和毒性标志物以及/或用于生物修复目的的相关性，符合"同一健康"（One Health）原则。
论文解读
一、研究背景与科学问题
水生环境中细菌、古菌、原生生物和真菌主导着包括有机物降解和养分循环在内的关键生物地球化学过程。水体天然富含通过岩石风化和淋溶释放的金属元素，虽然许多金属是必需的微量营养素，但当其浓度升高——通常源于农业、工业和城市输入——就会对微生物群落产生毒性，进而干扰生物地球化学循环。重金属不可生物降解，因此在环境中长期存留。在此背景下，细菌进化出多种耐受机制，如外排泵、酶解毒和生物吸附，这些耐受性状通常由染色体、质粒或其他可移动遗传元件上的基因编码。由于这些可移动元件同样可能携带赋予不同外源物质抗性的基因，金属胁迫可能选择出对抗生素和农用化学品等其他杀菌剂的抗性，引发环境和人类健康的双重担忧。
深层地下和深海环境的微生物栖息地是地球上探索最少的区域之一，其微生物群落的抗性和耐受表型在很大程度上仍未得到表征。尽管这些环境通常被认为是原始的，但多项研究表明它们受到人类活动的干扰，包括那些增加重金属浓度的活动。然而，针对深层水生环境细菌重金属耐受性的研究仍然稀缺，南半球生态系统在此类研究中更是探索最少。
本研究聚焦于巴西南部的两个深层水生环境：瓜拉尼含水层系统（GAS）和里奥格兰德锥（RGC）。GAS是一个跨越巴西、巴拉圭、乌拉圭和阿根廷巴拉那河流域约1,100,000 km2的承压地下水系统，是南美洲最大的淡水水库之一。人为输入的重金属（如铁、铝和硒）通过地表渗流进入含水层，可能已在塑造其原生微生物群的抗性和耐受性特征。RGC则是位于巴西南部大陆边缘（佩洛塔斯盆地，南里奥格兰德州）约250,000 km2的深海沉积构造，承载着由甲烷渗漏维持的化能合成群落。尽管地理和地质上截然不同，GAS和RGC共享一些重要的生态特征，如与直接大气和人为接触的隔离以及低养分可利用性。评估这两个系统中细菌的金属耐受性，有助于深入了解这些相对偏远的环境在多大程度上受到金属暴露的影响。
二、主要技术方法
研究人员从GAS水样和RGC深海沉积物中分别获得12株细菌分离株，共24株，涵盖芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属、假单胞菌属、类芽孢杆菌属、葡萄球菌属和短芽孢杆菌属等。研究采用最低抑菌浓度（MIC）测试评估细菌对重金属的耐受性，其中GAS分离株测试铁（II）硫酸盐、亚硒酸钠和硫酸铝铵，RGC分离株测试乙酸汞、氯化铜（II）和氯化镍（II）。通过结晶紫染色法评估金属影响下的生物膜形成能力。利用扫描电子显微镜（SEM）结合能量色散X射线光谱（EDS）分析细胞形态变化及潜在金属纳米颗粒。通过PCR检测硒代谢相关基因selD和汞抗性标记基因merA。以铜绿假单胞菌ATCC 27853和蜡状芽孢杆菌ATCC 33019作为参考对照菌株。
三、研究结果
最低抑菌浓度（MIC）测定
对于GAS分离株，铁（II）硫酸盐的MIC值介于8 mM（42%分离株）至16 mM（58%分离株）之间，与参考菌株相当或更低。硫酸铝铵的MIC值大多为8 mM（75%分离株），高于ATCC 27853但与ATCC 33019相同。亚硒酸钠方面，大多数GAS分离株的MIC值是参考菌株的两到四倍。值得注意的是，芽孢杆菌属VB5是唯一在所有三种金属中均表现出最高MIC值的GAS分离株，表明其对铁（II）硫酸盐、硫酸铝铵和亚硒酸钠具有突出的耐受性。未鉴定的CAP3和NSP5分离株也对三种金属表现出高浓度耐受性。此外，暴露于亚硒酸钠的分离株呈现出独特的橙红色菌落。
对于RGC分离株，所有芽孢杆菌和类芽孢杆菌分离株对乙酸汞的MIC为0.125 mM，与参考菌株相同，而大多数假单胞菌属（6株中的4株）表现出较低的0.06 mM MIC。氯化铜（II）方面，大多数分离株的MIC与参考菌株相同（67%）或低于参考菌株（25%），但类芽孢杆菌属MET17表现出最高的MIC值（16 mM）。氯化镍（II）的MIC大多与参考菌株相同（50%）或低于参考菌株（33%），两株分离株达到16 mM。假单胞菌属MD332.08和巨大芽孢杆菌MR06表现出突出的耐受水平，前者还拥有第二高的氯化铜（II）MIC值。
金属对生物膜形成的影响
在GAS分离株中，亚硒酸钠MIC值等于或低于64 mM的分离株在24小时暴露下均能在至少某些浓度形成生物膜。所有分离株在64 mM亚硒酸钠条件下24小时均表现出中等或强烈的生物膜形成，该浓度等于或高于其相应MIC值。CAP分离株尤为突出，能在超过其MIC值的浓度下形成生物膜。对于MIC超过64 mM的GAS分离株，NSP5、CAP3和GRU33的生物膜形成和强度随金属浓度增加至中等范围（2–16 mM）而增强，达到中等至强烈的生物膜。NSP5在2–32 mM的广泛范围内维持强烈生物膜形成。相比之下，参考菌株主要表现出弱或无生物膜形成。
在RGC分离株中，MIC为0.06 mM的分离株大多在乙酸汞浓度超过其MIC值（多数超过16倍）的条件下仍能形成生物膜。MD330.06在0.5 mM浓度下产生强烈生物膜，表明该金属对其生物膜形成具有更强的促进作用。MIC为0.125 mM的分离株生物膜形成普遍较弱，但芽孢杆菌MR29表现突出，在0.06至8 mM范围内形成强烈或中等生物膜。
扫描电子显微镜（SEM）分析
GAS分离株VB5和GRU33的SEM图像显示，在亚硒酸钠处理组中观察到球形细胞外纳米颗粒（直径145.7–332.3 nm），EDS分析确认这些纳米颗粒中存在硒特异性峰，与硒纳米颗粒的预期直径一致。细菌细胞形态在128 mM亚硒酸钠处理下也发生明显改变。RGC分离株MD330.11和MET16在乙酸汞处理下同样观察到球形细胞外矿物颗粒（直径1.830–3.488 μm），对照组中不存在，同时观察到附着于类似细菌EPS（胞外聚合物）基质上的细针状和偏三角面体微结构，EDS分析确认这些颗粒中存在汞特异性峰。
汞抗性基因（merA）和硒代谢基因（selD）的检测
在GAS分离株中，仅CAP3存在selD基因（约500 bp），该分离株的亚硒酸钠MIC为128 mM，是检测到的第二高值。在RGC分离株中，巨大芽孢杆菌MR06的PCR结果与该基因的存在相符（约400 bp），其乙酸汞MIC为最高检测值（0.125 mM）。两株假单胞菌属（MD330.11和MD332.08）也呈现merA基因阳性，但扩增片段大小略有差异（约600 bp），与预期目标片段（431 bp）不同。先前通过全基因组测序在假单胞菌MD330.06中检测到的mer操纵子无法通过通用merA引物经PCR检测，序列比对分析表明反向引物与目标区域仅有63%的同一性，这解释了扩增片段大小差异的原因。
四、结论与意义
本研究揭示了来自GAS和RGC两个深层水生环境的细菌分离株对重金属具有不同程度的耐受性。GAS分离株对铁、铝和硒表现出较高耐受性，其中部分菌株能在超过参考菌株两至四倍的亚硒酸钠浓度下生长，并形成强烈的生物膜。RGC分离株对汞的耐受性有限，但部分菌株在铜和镍耐受方面表现突出。SEM分析证实了硒纳米颗粒和含汞矿物颗粒的形成，以及金属暴露引起的细胞形态改变。基因检测在部分高耐受菌株中确认了selD和merA基因的存在。
这些结果表明，重金属可能干扰这些生态系统中微生物群落的结构和动力学。GAS中农业活动导致的重金属输入可能正在塑造其微生物群落的耐受性特征，而RGC中检测到的汞耐受性和相关基因提示这一"原始"深海环境已受到人类活动的影响。这些微生物表型特征可作为水污染和毒性的标志物，并具有生物修复应用潜力，符合"同一健康"（One Health）原则。研究同时指出，分离株的筛选标准可能增加了鉴定金属耐受菌株的可能性，不一定反映GAS和RGC更广泛细菌群落中耐受表型的整体流行率。
