肿瘤内CD8+ T细胞浸润与空间组织的多级检查点：免疫排斥机制、屏障及空间引导联合治疗策略

《Molecular Biomedicine》：CD8? T Cell infiltration and spatial organization in cancer: mechanisms, barriers, and therapeutic strategies

CD8⁺ T淋巴细胞对肿瘤的浸润是抗肿瘤免疫和免疫治疗应答的关键决定因素。然而，肿瘤特异性CD8⁺ T细胞的存在并不一定转化为有效的肿瘤控制，因为多种生物屏障可阻止其募集、空间分布、持续存在和功能活性。本综述全面概述调控CD8⁺ T细胞浸润的多步骤机制，从免疫致敏（immune priming）和全身运输到血管进入、瘤内迁移和组织驻留。研究人员讨论趋化因子网络改变、肿瘤血管功能障碍、细胞外基质（ECM）重塑、间质屏障和免疫抑制信号如何共同驱动免疫排斥和治疗抵抗。与既往聚焦于T细胞运输、肿瘤免疫背景或免疫排斥某一方面的综述不同，研究人员将这些相互关联的机制整合为连续的生物检查点，并将其与旨在克服特定屏障的治疗策略相联系。这些策略包括恢复抗原呈递和树突状细胞（DC）功能、重编程趋化因子通路、血管正常化、间质重塑、固有免疫激活以及诱导三级淋巴结构（TLS）。这一整合框架强调了为何单纯增加CD8⁺ T细胞浸润可能不足，并支持理性、序贯和空间引导的联合策略开发。空间转录组学（spatial transcriptomics）、单细胞技术（single-cell technologies）和多重成像（multiplex imaging）的进展有望实现优势免疫屏障的个体化识别及联合治疗的理性设计。最终，目标正在从单纯激活T细胞转向工程化肿瘤生态系统，以支持持续的CD8⁺ T细胞浸润、组织和效应功能。

引言
高CD8⁺ T细胞密度与多种癌症良好预后相关，但T细胞可功能受损、空间排除或耗竭。免疫检查点抑制剂（ICIs）靶向PD-1、PD-L1或CTLA-4，其疗效依赖肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞。肿瘤可分为“热”、“冷”和“免疫排除”表型，空间组织及三级淋巴结构（TLS）与抗肿瘤免疫和免疫治疗应答相关。本综述将CD8⁺ T细胞浸润视为多步骤过程，并将治疗策略映射至各检查点。

CD8⁺ T细胞募集至肿瘤的多步骤生物学
CD8⁺ T细胞在肿瘤内积累是协调的多步骤过程，包括淋巴器官致敏、全身运输、组织进入和外周组织早期适应。每一步由不同分子机制调控，并可能成为失败节点。

肿瘤特异性CD8⁺ T细胞的致敏与激活
树突状细胞（DC）捕获肿瘤抗原，在肿瘤引流淋巴结（TDLNs）经MHC-I呈递给初始CD8⁺ T细胞。有效激活依赖TCR信号、共刺激信号（CD80/CD86–CD28）和细胞因子信号。TLS亦可支持局部抗原呈递和T细胞致敏，如在非小细胞肺癌（NSCLC）中成熟TLS相关DC可直接致敏肿瘤特异性CD8⁺ T细胞。

向肿瘤的全身运输
CD8⁺ T细胞向肿瘤趋化主要由趋化因子梯度驱动，涉及CCR2、CCR5、CCR6、CXCR3、CXCR6和CX3CR1等受体。CXCR3结合CXCL9、CXCL10和CXCL11，与“热”肿瘤微环境（TME）及ICIs应答相关；CXCL11也可通过CXCR3-B和CXCR3-alt触发免疫调节。CCR5识别CCL3、CCL4、CCL5，促进效应T细胞积累。CCR2–CCL2轴也招募免疫抑制性髓系细胞。CCR6–CCL20促进向炎症组织和肿瘤龛运输。CX3CR1支持黏附、血管巡逻、存活和肿瘤浸润。CXCR6是组织驻留或半驻留T细胞标志，CXCL16促进其在肿瘤内滞留。

与血管内皮的相互作用
活化CD8⁺ T细胞表达整合素LFA-1和VLA-4，其功能激活受“由内而外”信号调控。肿瘤内皮配体ICAM-1和VCAM-1与上述整合素结合，确保抵抗血流剪切力的牢固黏附，为血细胞渗出所必需。

肿瘤血管进入
牢固黏附后，CD8⁺ T细胞经血细胞渗出穿越内皮屏障。IFN-γ和TNF-α等促炎细胞因子可激活内皮，上调ICAM-1和VCAM-1，增加血管通透性。但肿瘤血管常结构功能异常，内皮连接异常、周细胞覆盖受损，且可表达免疫抑制分子，如内皮素B受体、FasL，受VEGF-A、IL-10和PGE₂调控。抗血管治疗可部分恢复血管功能。

瘤内迁移与空间定位
血细胞渗出后，CD8⁺ T细胞以阿米巴运动穿越致密间质，依赖肌动蛋白重塑。ECM结构是关键决定因素，胶原和纤连蛋白丰富的致密ECM降低孔隙率并限制T细胞移动。CXCR3轴也影响空间组织；CXCL13由滤泡辅助T（Tfh）细胞和TGF-β刺激的间质细胞产生，促进TLS并关联抗PD-1应答。CCL20–CCR6轴参与局部免疫反应组织。

滞留、持续存在与驻留
CD8⁺ T细胞在肿瘤内滞留和持续存在对持久抗肿瘤免疫至关重要。组织驻留记忆T细胞（TRM）表达CD69和CD103，分别限制组织外迁和促进滞留，与良好预后和免疫治疗应答相关。CXCR6–CXCL16轴调节T细胞组织内维持。与抗原呈递细胞（APCs）持续相互作用可维持T细胞，但慢性抗原暴露可促进耗竭。TME中的缺氧、营养缺乏、腺苷和乳酸积累进一步损害T细胞存活和功能。

限制CD8⁺ T细胞浸润和空间组织的屏障
CD8⁺ T细胞在肿瘤内有效积累和组织需克服多重屏障。这些屏障决定T细胞是否到达肿瘤、定位何处及能否建立有效抗肿瘤应答。

运输失败
方向信号丧失
TME中CXCL9、CXCL10和CCL5等梯度常减少、异质或空间错位。CXCL9和CXCL10由CD103⁺ DC产生，是CD8⁺ T细胞浸润主要驱动因素，可受干扰素和cGAS–STING通路诱导，但可被致癌事件破坏，如β-catenin激活、TP53突变、EZH2和DNMT1介导的表观抑制。缺氧通过HIF-1α改变趋化因子表达，TGF-β减少炎性趋化因子。相反，CCL2过度产生招募单核细胞和髓源性抑制细胞（MDSCs）；CXCL12–CXCR4轴由癌症相关成纤维细胞（CAFs）介导，是T细胞排除的重要机制。

细胞反应性丧失
第二个较少探索的层面是CD8⁺ T细胞上趋化因子受体的表达和功能。TME如何改变其表达尚不清楚。CXCR3表达受TCR信号、KLF2、I型干扰素、IFN-γ、IL-12、T-bet和TGF-β–SMAD2/3调控。慢性刺激可能损害CXCR3表达。空间转录组学有望揭示瘤内定位如何影响趋化因子受体表达。

间质和物理排斥屏障
异常肿瘤血管由VEGF驱动，血管紊乱、灌注差、内皮黏附分子减少，限制CD8⁺ T细胞黏附和进入。ECM是第二物理限制，胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖沉积，ECM硬度增加，机械限制T细胞迁移。CAFs通过CXCL12富集间质龛将CXCR4表达T细胞滞留于肿瘤外周；FAP⁺ CAFs产生CXCL12，CXCR4抑制可重新分布T细胞。Tenascin-C结合CXCL12形成间质支架滞留T细胞。

免疫抑制性TME限制CD8⁺ T细胞募集
TGF-β由癌细胞、CAFs和抗炎免疫细胞产生，抑制CXCR3表达，某些CAF亚型（Endo180⁺）高产生TGF-β抑制CD8⁺ T细胞浸润。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）可极化为M2样，ID1表达和IL-15Rα⁺ TAMs降低CX3CL1而减少CD8⁺ T细胞募集。腺苷在缺氧糖酵解区域积累，由CD39（ENTPD1）和CD73（NT5E）产生，通过A2A和A2B受体增加cAMP，抑制TCR信号、细胞毒颗粒释放和IFN-γ、TNF-α产生，并破坏迁移。PGE₂由肿瘤、CAFs和髓系细胞过产生，通过EP1–EP4受体触发cAMP通路，并降低CXCL9和CXCL10产生。

增强CD8⁺ T细胞肿瘤浸润的治疗策略
策略聚焦恢复初始T细胞激活、调节趋化因子网络、肿瘤血管、间质屏障和免疫抑制通路，并可能互补影响募集、进入、空间组织、持续和效应功能。

恢复免疫致敏和抗原呈递
常规治疗可诱导免疫原性细胞死亡（ICD），释放肿瘤抗原和损伤相关分子模式（DAMPs），如钙网蛋白、ATP和HMGB1，并伴随HSP70/HSP90暴露或分泌，促进DC活化。病原体相关分子模式（PAMPs）传感器对I型干扰素和CXCL10产生重要。顺铂联合酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）可改善ICD。增强DC功能策略包括FLT3L、CD40激动和STING通路激活。STING激动剂临床转化受鼠与人STING差异、炎症毒性、半衰期和给药限制。TLS诱导是增强局部免疫致敏的另一机制，可通过LT-α、LIGHT、CCL21、CCL19、CXCL12、CXCL13、化疗、放疗、ICIs、溶瘤病毒、DC疫苗等探索，但TLS功能取决于成熟度、细胞组成、血管组织和抗原呈递能力。

重编程趋化因子网络和T细胞运输
恢复CXCL9/CXCL10可增强CD8⁺ T细胞募集。部分化疗诱导ICD产生梯度；MEK抑制剂可恢复CXCL10；奥拉帕利联合放疗激活cGAS–STING并促进CXCL9/10/11。顺铂可诱导CCL20和IL-1β，招募3型固有淋巴细胞（ILC3）产生CXCL10。但调节性T细胞（Tregs）也可表达CXCR3并迁移至CXCL10丰富区域。CXCL12–CXCR4抑制可破坏间质屏障，CXCR4拮抗剂Mavorixafor已获FDA批准，POL6326有潜力，但单药临床疗效有限，可能需联合。趋化因子受体工程改造嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞可改善运输，如CCR2b、CXCR2、CXCR1/2、CXCR3、CXCR6、CXCR4、CCR4，多数仍处临床前，CXCR4^high CD19⁺ CAR-T已有首次人体试验。

肿瘤血管正常化和内皮激活
抗血管治疗抑制VEGFR信号，目标为血管正常化并改善CD8⁺ T细胞浸润。过度抑制可加重缺氧。Jain提出血管正常化概念，正常化窗口短暂，小鼠中抗VEGFR2后2–8天。低剂量可产生更均一功能性血管。Bevacizumab靶向VEGF-A，联合化疗用于转移性结直肠癌（CRC）等，可减少Tregs并增加CD4⁺、CD8⁺、CD3⁺、CD20⁺淋巴细胞。Ramucirumab靶向VEGFR2，增加CD8⁺ T细胞浸润并减少Tregs。TKIs如Sunitinib增加CXCL10和CXCL11，Cabozantinib联合疫苗增加CD8⁺ T细胞浸润和细胞毒活性。但获益依赖时机和剂量。

靶向间质和ECM屏障
CAFs是间质屏障核心。Losartan减少胶原和透明质酸，改善灌注和药物递送；PEGPH20耗竭透明质酸；Tenascin C靶向抗体有生存获益。α-SMA⁺肌成纤维细胞清除可抑制血管生成但增加缺氧、上皮–间质转化和Tregs，导致更侵袭。FAP疫苗、FAP5-DM1、Sibrotuzumab、全反式维甲酸（ATRA）、吡非尼酮等探索。CAF异质性高，非选择性清除可能有害，选择性间质重编程更可取。

联合免疫治疗和理性整合
ICIs恢复已存在CD8⁺ T细胞活性，但在“冷”肿瘤中有限。增加募集不一定克服耗竭或免疫抑制。血管正常化改善物理进入但需已有免疫信号。当前策略依赖理性联合，将免疫排除肿瘤转化为允许环境。

免疫-血管重编程
化疗诱导ICD联合VEGF/VEGFR抑制有强生物学基础。转移性CRC中Bevacizumab联合奥沙利铂化疗改善无进展生存；XELOX联合Bevacizumab±PD-1阻断活化DC的过继细胞免疫治疗；NSCLC中IMpower150支持卡铂–紫杉醇–Bevacizumab–Atezolizumab。放疗联合VEGF/VEGFR抑制仍在研究。TLR7/8/9激动剂联合ICIs可将“冷”肿瘤转化为炎症肿瘤，多项临床试验显示可行性和免疫激活。STING激动剂联合VEGF/VEGFR抑制主要临床前，显示显著肿瘤消退。

靶向间质和免疫抑制屏障
靶向TGF-β联合免疫治疗可增加IFN-γ和CXCL10特征，促进自然杀伤（NK）细胞和T细胞扩增，部分病例从免疫排除转为免疫炎症。SRK-181联合Pembrolizumab、LBL-015、AdAPT-001、bintrafusp alfa等探索。靶向CXCL12–CXCR4联合免疫治疗：OPERA试验NOX-A12联合Pembrolizumab；Plerixafor联合Cemiplimab增加T细胞募集但巨噬细胞扩增限制疗效。CXCL12–CXCR4联合VEGF/VEGFR抑制：Plerixafor加Bevacizumab在胶质母细胞瘤；GLORIA试验NOX-A12加Bevacizumab。联合化疗和ICIs：COMBAT试验BL-8040加Pembrolizumab和伊立替康/5-FU在转移性胰腺导管腺癌（PDAC）增加CD8⁺ T细胞浸润、减少髓系抑制细胞，疾病控制率约77%。

诱导TLS以重组抗肿瘤免疫浸润
TLS诱导策略包括“配体优先”和“龛优先”。LIGHT-VTP融合蛋白诱导高内皮微静脉（HEVs）重塑和TLS形成，与PD-1/CTLA-4阻断协同。LTβR和LTα激活促进成熟TLS。生物材料和组织工程如GelMA支架、铁蛋白–节肢弹性蛋白水凝胶、共价有机框架等可局部持续呈递免疫组织信号。固有免疫激动剂如ZCCG水凝胶激活cGAS–STING和TLR9，OK432激活LTβR，促进TLS。ICIs、常规治疗、溶瘤病毒也可促进TLS。整合框架建议先ICD诱导抗原释放和炎症，再以LTβR/LIGHT和CXCL13/CCL19/CCL21组织淋巴龛，ICIs支持成熟，VEGF阻断血管正常化可插入。

未来方向
将机制转化为持久临床获益仍具挑战。单一通路干预不足，免疫排除由多种适应抵抗机制汇聚。未来需整合、空间信息和自适应策略，同时针对间质、血管、趋化和免疫抑制屏障。序贯治疗应视为时空TME重编程策略。空间免疫肿瘤学、单细胞测序和多重成像可高分辨率区分免疫沙漠与免疫排除。个性化医疗需分层TME。自适应多步骤框架需优化顺序和时机。实施障碍包括多药毒性、变量多、患者数大。血管正常化和免疫检查点联合已进入临床，TLS诱导、趋化因子受体工程、间质重塑和固有免疫激动剂仍多为实验性。单纯增加CD8⁺ T细胞密度可能不足。未来临床开发需预测性生物标志物。总体目标不再是单纯激活T细胞，而是工程化肿瘤生态系统以支持其浸润和效应功能。