绵羊心肺转流后额叶皮质神经炎症与循环生物标志物：脑组织氧合保留下的微胶质激活和星形胶质增生

《Intensive Care Medicine Experimental》：Frontal cortical neuroinflammation and circulating biomarkers following cardiopulmonary bypass in sheep

　　

背景：心脏手术后神经认知障碍中的脑缺氧和神经炎症已被认为参与，但其术后轨迹及与循环生物标志物的关系尚不明确。研究人员在绵羊中调查了心肺转流（cardiopulmonary bypass, CPB）后4周内的脑组织氧合、神经炎症及血浆神经退行性变生物标志物。

方法：16只成年Merino母羊接受CPB并经历2 h主动脉阻断，恢复48 h（n = 8）或4周（n = 8）。监测脑组织氧合。通过形态计量分析两组CPB组及na?ve对照组（n = 8）额叶皮质微胶质细胞（microglia）和星形胶质细胞（astrocytes）定量神经炎症。系列测量血浆神经丝轻链（neurofilament light chain, NfL）和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）。

结果：与CPB前基线相比，48 h或4周期间脑组织氧合无显著变化。在CPB后48 h组，与na?ve对照相比，微胶质胞体球形度降低（0.79 ± 0.04 vs. 0.83 ± 0.02，P = 0.018），提示微胶质激活。星形胶质GFAP阳性面积也升高（17 ± 2% vs. 10 ± 2%，P = 0.026）。在CPB后4周组，这些指标与na?ve对照无显著差异。血浆NfL从基线138 [96–185] pg/mL升至48 h的198 [149–265] pg/mL（P = 0.0007），而GFAP在CPB结束时达峰（14.4 [4.7–32.4] vs. 3.0 [1.3–4.5] pg/mL，P < 0.0001），并在48 h时正常化。

结论：CPB诱导了以额叶皮质微胶质激活和星形胶质增生为特征的神经炎症，并伴随血浆GFAP和NfL的时间性升高。这些发现将微胶质激活确定为在组织氧合保留情况下对CPB的反应，并提供了围术期神经炎症变化与循环生物标志物GFAP和NfL之间关联的初步证据，支持进一步研究。

心肺转流（cardiopulmonary bypass, CPB）相关围术期神经认知障碍常见，谵妄发生率最高达55%，并与短期发病率、死亡率、长期死亡率、后续痴呆风险及医疗成本增加相关。机制未完全明确，阻碍靶向治疗开发。脑组织缺氧和神经炎症被认为参与其中。临床近红外光谱（near-infrared spectroscopy, NIRS）提示术中脑去饱和与较差神经结局相关，但NIRS为间接测量，可受血液稀释和颅外组织信号影响；临床前直接测量则显示术中脑组织氧合维持。然而，术后脑组织氧合尚未被研究。神经炎症方面，微胶质（microglia）激活可能参与CPB相关神经认知障碍，额叶皮质（frontal cortex）较顶叶、颞叶和枕叶皮质更易感，但恢复期微胶质是否持续激活不清；星形胶质（astrocytes）在CPB后恢复期的变化也未被研究。血神经丝轻链（neurofilament light chain, NfL）和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）作为脑损伤和神经退行性变替代标志物，围术期升高已有报道，但其在CPB前、中、后的时间动力学及与额叶皮质组织病理神经炎症的关系不清。因此，研究人员建立具有4周恢复期的大型哺乳动物CPB模型，研究额叶皮质组织氧合、神经炎症（主要结局为CPB后48 h微胶质激活）及血浆NfL、GFAP，假设在无明显脑组织缺氧情况下，CPB诱导术后持续神经炎症，并伴血脑损伤和神经退行性变标志物升高。

研究人员纳入24只健康成年Merino母羊；16只接受标准化CPB及2 h主动脉阻断，分为CPB-48 h（n = 8）和CPB-4周（n = 8），另8只na?ve对照。结果发现，CPB后48 h额叶皮质出现星形胶质增生和部分微胶质激活，而CPB期间及术后脑组织氧合保留；这些变化在4周后未显著。血浆GFAP在CPB结束时达峰，NfL在48 h升高，与组织神经炎症时间相关。研究提示CPB本身足以在无明显缺氧下诱导短暂神经炎症，支持靶向神经炎症及进一步验证循环生物标志物。

关键技术方法（不超过250字）：研究纳入24只健康成年Merino母羊，伦理批准于Florey Institute of Neuroscience and Mental Health。16只接受标准化CPB和2 h主动脉阻断，分配至CPB-48 h（n = 8）和CPB-4周（n = 8），另8只na?ve对照。术前植入双侧颈动脉环和额叶皮质光纤探头，直接监测脑组织氧张力（cerebral tissue oxygen tension, tPO₂）和灌注。系列血样用酶联免疫吸附试验测白介素-6（interleukin-6, IL-6）和IL-10，用单分子阵列（single molecule array, SIMOA）测NfL和GFAP。终点取脑，对额叶皮质40 μm切片行离子钙结合衔接分子1（ionised calcium-binding adaptor molecule 1, Iba1）、GFAP和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）免疫荧光，Imaris分析微胶质形态，ImageJ分析GFAP面积和荧光强度。CPB-4周组因组织保存问题仅5个脑用于免疫组化。

结果：

免疫组织化学（Immunohistochemistry）。通过额叶皮质免疫荧光和形态计量，CPB-48 h组微胶质胞体球形度较na?ve对照降低（0.83 ± 0.02 vs. 0.79 ± 0.04，P = 0.018），提示微胶质激活；分支参数和Sholl分析未见组间差异。CPB-4周组胞体球形度与na?ve无差异（0.80 ± 0.02，P = 0.16）。星形胶质GFAP阳性面积在CPB-48 h组较na?ve增加（P = 0.030）；GFAP面积和荧光强度在CPB-48 h与CPB-4周组间存在显著差异（P = 0.013；P = 0.022）；CPB-4周与na?ve无显著差异。

系统血流动力学（Systemic haemodynamics）。通过CPB期间及术后血流动力学监测，CPB期间平均动脉压（mean arterial pressure, MAP）和动脉血氧含量显著降低；术后48 h内MAP在12 h和24 h降低，48 h回到基线；动脉血氧含量所有时间点低于基线；全身氧输送、氧耗和氧摄取率无显著变化。1–4周MAP稳定，无显著时间变化。

脑氧合和灌注（Cerebral oxygenation and perfusion）。通过直接测量，CPB期间脑tPO₂和灌注较基线无显著差异；术后48 h无显著变化；1–4周也保持稳定。

脑损伤和全身炎症血浆生物标志物（Plasma biomarkers of brain injury and systemic inflammation）。通过系列血浆检测，48 h内NfL随时间升高：基线138 [96–185] pg/mL，24 h 195 [115–319] pg/mL（P = 0.023），48 h 198 [149–265] pg/mL（P = 0.0007）。GFAP从基线3.0 [1.3–4.5] pg/mL升至CPB结束峰值14.4 [4.7–32.4] pg/mL（P < 0.0001），随后下降，48 h为2.7 [1.8–17.1] pg/mL，与基线无显著差异（P = 0.82）。4周时NfL（62 ± 18 pg/mL）低于术前基线（112 ± 48 pg/mL，P = 0.017），GFAP与基线无显著差异（P = 0.55）。IL-6在48 h内升高，从基线0.68 [0.47, 2.38] ng/mL峰值至CPB时1.65 [1.03, 5.08] ng/mL（P = 0.0062），后降至48 h 0.55 [0.25, 1.70] ng/mL；IL-10无显著改变（P_time = 0.19）。1–4周IL-6和IL-10与基线无显著差异。

讨论部分总结：

关键发现（Key findings）。在大型哺乳动物CPB模型中，48 h额叶皮质出现神经炎症，表现为星形胶质增生和部分微胶质激活，且CPB期间及术后脑组织氧合保留；该神经炎症反应看似短暂，4周时未见到。组织学星形胶质增生和部分微胶质激活与循环GFAP在CPB期间及NfL在48 h的时间变化同时出现。研究未设计或把握度不足以确定这些生物标志物的诊断准确性或临床效用。

与既往研究关系（Relationships with previous studies）。研究人员未观察到CPB期间额叶皮质组织缺氧或低灌注，与既往直接测量一致。NIRS可间接反映脑氧合并受血液稀释和颅外信号影响；本研究术后4周显示额叶皮质组织氧合和灌注维持。该结果支持CPB相关神经并发症可独立于脑内无菌炎症反应。既往发现CPB末额叶最易感；本研究中48 h微胶质胞体球形度降低符合激活状态，但分支指标无变化，提示可能未完全激活或处于修复过程。CPB神经炎症可能由血液接触CPB管路异物表面、循环促炎细胞因子升高和血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）破坏介导；临床MRI和脑脊液白蛋白证据支持。48 h神经炎症表型较CPB末减弱，与血浆IL-6在CPB末峰值后下降一致。研究人员还观察到48 h星形胶质增生，GFAP阳性面积增加；既往无研究直接评估CPB对星形胶质影响。4周GFAP面积正常化，提示年轻健康动物中CPB相关神经炎症短暂，无持久大体形态改变；但分子变化、深部脑区及衰老和共病情况需研究。临床术后血GFAP升高已有报道，但意义不清；星形胶质增生与血浆GFAP正常化机制不同。NfL术后升高常见，体外循环（on-pump）大于非体外循环（off-pump）；临床效用不确定，术前NfL而非术后第1天升高与谵妄相关，术后NfL升高与1年认知下降相关。GFAP直接反映星形胶质增生，NfL反映轴突损伤。

研究意义（Study implications）。在推荐灌注策略下，保留脑组织氧合和灌注并不能预防神经炎症和脑损伤；CPB相关星形胶质增生至少持续48 h，提示持续神经炎症可能参与术后神经并发症，支持靶向神经炎症。GFAP在CPB末达峰，符合早期星形胶质增生指标；NfL升高更持久，可能反映持续或延迟轴突损伤。研究支持CPB后神经炎症反应，并产生关于组织神经炎症与循环生物标志物关系的假设，需足够把握度研究验证NfL和GFAP是否可靠反映围术期脑损伤。

优势与局限（Strengths and limitations）。优势：综合评估系统血流动力学、脑微循环、神经炎症和血脑损伤标志物；首次描述CPB后微胶质和星形胶质及相关血标志物延长时间变化；模型复制临床CPB关键方面，包括泵流量、灌注压、温度、抗凝管理、麻醉药和2 h主动脉阻断及心脏停搏；由临床医生共同设计实施；直接测量脑组织氧合，避免NIRS限制。局限：年轻健康羊不完全代表临床异质人群；未进行认知评估；术后镇痛使用氟尼辛葡甲胺（非甾体抗炎药）可能减弱炎症反应；模型仅CPB和主动脉阻断，无心脏手术；仅用雌羊；CPB-4周组仅5个脑用于免疫组化；经右侧开胸。

结论（Conclusions）。在临床相关的大型哺乳动物CPB模型中，研究人员证明CPB后48 h额叶皮质存在星形胶质增生和部分微胶质激活，并在CPB后4周消退，且这些变化发生于CPB期间和之后组织氧合保留的情况下。这些发现证实存在独立于明显缺氧损伤的CPB神经炎症反应。额叶皮质组织神经炎症变化与血浆NfL和GFAP升高相关，提示其作为术后脑损伤生物标志物的潜在用途，因此值得进一步研究。