《Journal of Molecular Neuroscience》：Comprehensive Transcriptomic Analysis Identifies Potential Biomarkers and Underlying Mechanisms of Acupuncture in Treating Peripheral Facial Paralysis
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周围性面瘫（peripheral facial palsy，PFP）是一种常见的神经系统疾病。针刺是一种有效的治疗干预，但其潜在分子机制仍未完全阐明。为评估针刺治疗PFP的临床疗效，并通过全转录组分析鉴定差异表达RNA（differentially expre
周围性面瘫（peripheral facial palsy，PFP）是一种常见的神经系统疾病。针刺是一种有效的治疗干预，但其潜在分子机制仍未完全阐明。为评估针刺治疗PFP的临床疗效，并通过全转录组分析鉴定差异表达RNA（differentially expressed RNAs）及相关通路，从而揭示潜在分子机制。临床疗效采用House-Brackmann（HB）量表、面部残疾指数（Facial Disability Index，FDI）及综合中医（traditional Chinese medicine，TCM）疗效标准进行评估。在针刺治疗前后采集患者外周血样本。通过全转录组测序筛选差异表达circRNA（circular RNA）、lncRNA（long non-coding RNA）、miRNA（microRNA）和mRNA（messenger RNA）。采用生物信息学分析构建竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）网络，并进行基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。针刺显著改善了治疗后临床评分。共鉴定出1625个差异表达mRNA（1153个上调，472个下调）、715个lncRNA（321个上调，394个下调）、85个circRNA（56个上调，29个下调）和253个miRNA（141个上调，112个下调）。ceRNA网络显示，非编码RNA竞争性结合关键miRNA分子，形成两个不同且独立的调控轴，精确调控下游靶基因。核心分子靶点的KEGG富集分析表明其显著参与嗅觉转导（Olfactory transduction）和JAK-STAT信号通路。针刺可能通过调节ceRNA网络以及嗅觉转导和JAK-STAT信号通路，协同促进神经再生并抑制神经炎症，从而对PFP发挥治疗作用。
研究背景与目的：周围性面瘫（peripheral facial palsy，PFP）由面神经下运动神经元损伤所致，是临床常见疾病，主要表现为患侧额纹减少、鼻唇沟变浅或消失，可伴眼睑闭合不全、味觉障碍、耳痛和面部麻木。面神经为混合神经，控制面部肌肉运动和腺体分泌，是最易发生麻痹的脑神经，PFP为临床最常见类型。PFP发病率为20～30/10万，全球每年约4万新病例，无明显性别优势。单侧面肌麻痹常导致焦虑、抑郁、社会功能受损和生活质量下降。2020年一项面瘫meta分析提示，激素联合抗病毒治疗急性面瘫的疗效仍存在争议。在中国，针刺是常用临床治疗，已有临床研究显示其对PFP有效，并有网络meta分析对不同针刺方法的疗效进行排序。针刺治疗PFP具有操作简便、疗效明显、安全性较好和成本较低等优势，但其作用机制尚未完全阐明。既往研究探讨了神经修复、免疫调节和局部微循环改善等途径，但缺乏转录组水平“基因-通路-疗效”关系的系统分析。因此，研究人员开展自身对照临床试验，评估针刺治疗PFP患者的临床疗效和安全性，并从转录组角度利用高通量测序筛选PFP患者针刺干预后外周血差异表达基因，通过生物信息学分析鉴定差异基因富集的关键信号通路，构建“基因-通路-疗效”关联网络。
关键技术方法：研究人员纳入2024年4月至12月甘肃中医药大学附属医院针灸中心及北部分院针灸科PFP患者，病程超过3个月，年龄18～80岁，2周内未接受相关治疗，采用治疗前后自身配对设计，无独立对照组。疗效以H-B量表、FDI和TCM综合症状疗效标准及安全评估判定。治疗前后采集外周血，行全转录组测序筛选差异circRNA、lncRNA、miRNA和mRNA。采用RNAhybrid v2.1.1、miRanda v3.3a和TargetScan v5.0联合预测靶向关系，TargetFinder v1.6验证，Cytoscape 3.9.1构建ceRNA网络；Metascape进行GO和KEGG富集分析，ClusterProfiler v4.4.4可视化；SPSS 26.0统计分析，FDR<0.05。
研究结果：
疗效与安全性评价结果：通过H-B、FDI、TCM综合疗效标准及安全监测评价。针刺治疗后临床总有效率超过70%，达到“显效”及以上，无不良事件发生。
面神经功能评分（H-B量表）结果：H-B评分为分类数据，以n（%）表示，卡方检验或Fisher精确检验显示治疗前后H-B评分差异有统计学意义（P<0.001）。
躯体功能（FDIP）评分结果：FDIP前后差值不符合正态分布，采用Wilcoxon符号秩检验。治疗前FDIP中位数为40.00（30.00，57.50），治疗后为100.00（77.50，100.00），配对差中位数为46.25（37.5，57.5），Z=-2.527，P=0.012，提示躯体功能显著改善。
社会功能（FDIS）评分结果：FDIS前后差值不符合正态分布，采用Wilcoxon符号秩检验。治疗前FDIS中位数为64.00（61.00，70.00），治疗后为28.00（12.00，36.00），配对差中位数为?40.00（-48.00，-30.00），Z=-2.524，P=0.012，提示社会功能显著改善。
综合疗效评价与安全性：针刺治疗后所有PFP患者临床总有效率超过70%，达到“显效”及以上，未发生不良事件。
样本RNA质量与测序数据：mRNA、lncRNA、circRNA的Clean reads比例≥90%，Q30碱基百分比≥90%，GC含量41%～52%，比对参考基因组（hg38）的unique mapping rate>90%；miRNA的Clean reads比例≥92%，Q30碱基百分比≥95%，与miRBase v22.0人类成熟miRNA序列比对率为68.64%～91.05%。
差异RNA筛选：通过全转录组高通量测序和生物信息学分析，筛选出1625个差异表达mRNA（1153个上调、472个下调）、715个lncRNA（321个上调、394个下调）、85个circRNA（56个上调、29个下调）和253个miRNA（141个上调、112个下调）。聚类分析显示治疗前后样本RNA表达谱具有明显分组聚类特征。
功能注释与通路富集分析：GO注释显示四类RNA具有不同分类倾向。mRNA在生物学过程主要富集于细胞过程、单生物过程和生物调节，细胞组分主要富集于细胞、细胞部分和细胞器，分子功能集中于结合和催化活性；miRNA富集于DNA模板转录调节、代谢调节，细胞膜整合成分，序列特异性DNA结合等；lncRNA集中于基因表达、RNA代谢过程、RNA代谢正调控，核质、胞质和核，RNA结合；circRNA富集于白细胞介素-6介导的信号通路和蛋白自噬过程、反式高尔基网络和核体、核糖体结合和组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶活性等。KEGG注释显示差异分子多富集于人类疾病相关通路：mRNA显著富集于产热、非酒精性脂肪性肝病和亨廷顿病等；miRNA显著富集于凋亡、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染和单纯疱疹病毒1型感染等；lncRNA显著富集于GnRH信号通路、肌萎缩侧索硬化和亨廷顿病等；circRNA显著富集于癌症中的MicroRNAs和卟啉与叶绿素代谢等。
ceRNA网络构建结果：Venn图显示核心调控mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA分别为6、112、311和5个。构建的ceRNA网络包含20个节点和29条互作边，形成“lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA”协同调控模型。核心节点包括lncRNA MSTRG.475685.26、MSTRG.475685.25、MSTRG.362899.1，circRNA节点9:110136127|110,138,539，miRNA节点hsa-miR-7974、unconservativeX_341096、unconservative_11_63760、hsa-miR-6726-3p，以及多个mRNA节点。网络形成两个独立调控轴：其一，circRNA（9:110136127|110138539）竞争性结合hsa-miR-7974，调控OR51E2（ENSG00000134817）、SOCS3（ENSG00000196169）、GABRA4（ENSG00000100003）、EGFR（ENSG00000184012）、NCAM1（ENSG00000100994）及新基因Human_newGene_111503、Human_newGene_192582；其二，lncRNA MSTRG.475685.26和MSTRG.475685.25可能经上调lncRNA unconservative_11_63760，协同竞争性结合unconservativeX_341096，调控SEMA3A（ENSG00000170525）、PLXNB1（ENSG00000160233）、ROBO1（ENSG00000102870）及新基因Human_newGene_122780；lncRNA MSTRG.362899.1可能经上调hsa-miR-6726-3p靶向调控Human_newGene_237177。核心分子的KEGG富集分析显示显著富集于嗅觉转导（Olfactory transduction）和JAK-STAT信号通路。
讨论与结论总结：该研究显示针刺治疗PFP临床疗效指数超过70%，显著改善量表评分。全转录组分析提示，针刺通过ceRNA网络调控OR51E2、SOCS3、GABRA4、EGFR、NCAM1、SEMA3A、PLXNB1、ROBO1及若干新基因，KEGG富集显示这些分子与嗅觉转导和JAK-STAT信号通路高度相关。PFP涉及面神经损伤后感觉和运动功能障碍，面神经损伤可经三叉神经间接中断嗅觉转导通路。针刺作为多靶点、温和、持续的物理刺激，可调节血浆外泌体中circRNA表达谱；circRNA闭环结构较线性RNA稳定，可作为内源分子海绵隔离hsa-miR-7974，维持下游靶基因表达，这种持续信号调节对嗅觉转导通路感觉功能恢复重要，提示针刺可能增强面神经再生。lncRNA调控的SEMA3A和ROBO1是神经发育和损伤修复关键分子，SEMA3A参与轴突导向并抑制异常分支，ROBO1作为SLIT家族受体介导神经免疫相互作用，PLXNB1为SEMA4D等轴突导向分子受体，调节生长锥塌陷和胶质-神经元通讯。PFP中轴突破坏和胶质细胞激活是核心病理变化，针刺可能通过lncRNA解除miRNA介导的转录后抑制，促进SEMA3A、ROBO1和PLXNB1表达，促进神经修复。Liu et al.鉴定的SLIT2-ROBO轴为PFP关键候选治疗靶点，SLIT2可参与神经免疫相互作用，通过调节小胶质细胞炎症、抑制性神经元兴奋性和胶质-神经元通讯促进神经修复，为PFP治疗提供互补理论基础。嗅觉转导通路核心组件嗅觉受体已被证实可作为中枢神经系统损伤后神经修复和功能恢复的潜在靶点；该研究首次报道ENSG00000134817（OR51E2），其表达可促进神经修复，相关机制包括靶向齿状回调节神经祖细胞增殖、分化和存活，促进成体神经发生，并通过调节神经递质释放效率、离子通道活性和突触连接强度改善受损神经元信号传导和突触可塑性。JAK-STAT通路是炎症和免疫反应核心介导者，面神经损伤后过度激活可加剧神经炎症并导致雪旺细胞功能障碍。既往研究证实针刺可抑制自身免疫疾病和神经炎症中的JAK-STAT通路过度激活；该研究数据进一步提示，针刺可通过ceRNA网络调节该通路，其中SOCS3为JAK-STAT信号负调节因子，可通过隔离hsa-miR-7974而上调，抑制过度炎症反应，形成“针刺-circRNA-hsa-miR-7974-SOCS3-JAK-STAT”抗炎调节轴。讨论还从GO三类层面解释外周血清转录谱与局部病变的联系：生物学过程方面，mRNA富集于基础细胞活动、物质运输和细胞定位调节，介导外周免疫细胞迁移、黏附和激活；miRNA富集于转录和代谢调节，作为转录后抑制子抑制过度免疫细胞活化；lncRNA靶向RNA代谢和基因表达正调控，在核内与转录因子协同放大促炎基因转录信号；circRNA富集于IL-6信号通路和自噬相关过程，IL-6驱动局部水肿和炎症细胞浸润，自噬调节雪旺细胞存活和破碎髓鞘清除，提示circRNA连接系统炎症与局部神经元损伤修复。细胞组分方面，mRNA分布于胞质和细胞器，miRNA富集于细胞膜整合成分，lncRNA主要位于核和核质，circRNA富集于核体和高尔基反面网络，支持四类RNA的亚细胞定位特异性作用。分子功能方面，mRNA提供核酸结合、ATP结合和催化活性，miRNA通过序列特异性DNA结合和转录因子活性调节靶基因，lncRNA通过RNA结合作为分子海绵，circRNA富集于核糖体结合和组蛋白甲基转移酶活性，对炎症和自噬相关基因进行双重调控。KEGG分析提示，mRNA富集于神经退行性疾病、代谢驱动炎症和产热通路，miRNA和lncRNA主要富集于单纯疱疹病毒1型感染通路，circRNA富集于癌症相关miRNA和卟啉代谢通路。整合分析表明，局部面神经病变可重塑循环mRNA和多种非编码RNA表达谱，外周血转录组动态变化可客观反映局部炎症消退和神经修复治疗反应，为血清转录组生物标志物评估面神经炎疾病严重程度和治疗疗效提供多层次分子生物学证据。局限性包括部分样本miRNA比对率低于预设80%阈值，可能影响低丰度miRNA定量及靶向预测和通路富集分析精度；样本量和临床特征覆盖有限，可能限制结果外推；仅采集外周血清，缺乏匹配的面神经组织转录组数据，无法直接比较局部病变组织与外周循环RNA表达特征。未来方向包括优化实验流程和扩大样本量，纳入不同年龄、病程、面瘫亚型和合并症患者并进行分层分析；收集病灶周围面神经组织进行多组学正交验证，建立外部临床队列验证血清转录标志物的诊断价值和治疗监测效能；利用蛋白质组学和代谢组学验证嗅觉转导和JAK-STAT通路下游效应蛋白，完善“ceRNA轴-通路-效应蛋白”调控级联；开发基于核心靶点的靶向药物，开展“针刺+靶向药物”联合治疗的动物实验和临床预试验。
研究结论翻译：针刺可能通过调节ceRNA网络以及嗅觉转导和JAK-STAT信号通路，协同促进神经再生并抑制神经炎症，从而对PFP发挥治疗作用。
