《Journal of the American Heart Association》：USP11 Drives Cerebral Ischemia–Reperfusion Injury Via Promoting Ferroptosis by Deubiquitinating and Stabilizing ASK1
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背景：脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia–reperfusion injury, CIRI）是包括脑卒中在内的缺血性脑血管疾病的关键病理机制。目前尚缺乏有效的预防或治疗方法。泛素特异性蛋白酶11（ubiquitin‐specific prot
背景：脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia–reperfusion injury, CIRI）是包括脑卒中在内的缺血性脑血管疾病的关键病理机制。目前尚缺乏有效的预防或治疗方法。泛素特异性蛋白酶11（ubiquitin‐specific protease 11, USP11）是分布最广的泛素化特异性蛋白酶（USP）家族成员之一。已有研究表明，USP11在多种疾病中发挥多样且重要的作用，如肝细胞癌、前列腺癌和椎间盘退行性变。然而，其在CIRI中的确切功能及分子机制仍不清楚。
方法：研究人员建立了USP11基因敲除（USP11‐KO）和腺相关病毒9介导的USP11过表达（USP11‐OE）小鼠CIRI模型，并利用USP11敲低和过表达腺病毒建立细胞模型，以在体内和体外研究USP11对CIRI的影响。通过分子生物学研究阐明USP11在CIRI中介导铁死亡的机制。
结果：USP11在CIRI期间表达升高。功能上，USP11缺失可减轻CIRI期间的神经功能缺损、脑梗死、神经炎症和铁死亡，而USP11的特异性过表达则加剧这些病理过程。此外，USP11敲低抑制神经元损伤、炎症反应和铁死亡，而USP11过表达则促进这些过程。机制上，USP11与凋亡信号调节激酶1（apoptosis signaling‐regulating kinase 1, ASK1）结合并抑制其K48连接的泛素化，从而增强ASK1‐JNK/p38信号通路的活性。更重要的是，USP11对神经元铁死亡和CIRI的调控依赖于其对ASK1‐JNK/p38信号轴的调控。
结论：该研究阐明了USP11在CIRI中的新功能和新机制。靶向USP11‐ASK1‐JNK/p38‐铁死亡轴可能成为预防和治疗CIRI的新策略。
论文解读
一、研究背景与意义
脑卒中以高发病率、高致残率和高死亡率为特征，是全球第二大死亡原因，其中缺血性脑卒中（ischemic strokes, IS）占脑卒中总数的70%，严重威胁人类健康。目前，溶栓治疗和机械取栓是治疗IS的常用手段，但部分患者在血流恢复后出现临床症状加重，这一现象被称为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia–reperfusion injury, CIRI），已被证实对IS患者的预后产生显著不利影响。因此，深入研究CIRI的干预靶点，开发有效治疗药物，对改善IS患者的治疗预后具有重要意义。
CIRI的病理生理过程涉及炎症、氧化应激、兴奋性毒性、线粒体功能障碍、血脑屏障损伤和程序性细胞死亡等多个相互关联的环节。铁死亡（ferroptosis）作为一种新型的铁依赖性程序性细胞死亡方式，以铁代谢异常和脂质过氧化升高为特征。谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）是调控铁死亡的核心分子，可将有毒的脂质过氧化物还原为无毒脂醇；而脂质代谢酶酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（acyl‐CoA synthetase long‐chain family member 4, ACSL4）则通过促进多不饱和脂肪酸酯化为酰基辅酶A增强脂质过氧化物产生，促进铁死亡发生。在CIRI中，铁代谢紊乱导致细胞内Fe2?增加，与H?O?和脂质发生Fenton反应，产生过量自由基，引发脂质过氧化和细胞膜损伤，最终导致铁死亡。铁死亡产生的脂质过氧化物及细胞破裂释放的损伤相关分子模式进一步加剧炎症反应，炎症与铁死亡的相互作用共同促进CIRI进展。已有研究证实抑制铁死亡可有效减轻脑缺血再灌注损伤，提示铁死亡是CIRI相关神经元损伤发生发展的核心环节。
泛素化修饰是一种高度保守且可逆的翻译后修饰，去泛素化酶因其可通过泛素化修饰调控关键蛋白的稳定性与活性，已被广泛研究作为药物靶点。泛素特异性蛋白酶11（ubiquitin‐specific protease 11, USP11）是分布最广的泛素化特异性蛋白酶（USP）家族成员，定位于Xp11.23位点，在人脑组织中高表达，在肝细胞癌、前列腺癌等多种疾病中通过去泛素化发挥重要作用。已有研究证实USP11通过泛素化修饰调控铁死亡，参与椎间盘退行性变、肺鳞状细胞癌、结直肠癌和脊髓缺血再灌注损伤等多种疾病的发生发展。然而，USP11是否通过铁死亡参与CIRI的病理过程，以及USP11在CIRI中调控铁死亡的机制尚不清楚。本研究正是基于这一科学问题展开。
二、研究内容与主要结论
该研究首次揭示了USP11在CIRI中的功能与机制。研究发现，USP11在CIRI期间表达上调。功能上，USP11缺失可抑制CIRI小鼠的神经功能缺损、脑梗死、神经炎症和铁死亡，而USP11过表达则加剧这些病理过程。体外实验中，USP11敲低抑制氧糖剥夺/复氧（oxygen glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R）诱导的神经元损伤、炎症反应和铁死亡，USP11过表达则促进这些过程。机制上，USP11与凋亡信号调节激酶1（apoptosis signaling‐regulating kinase 1, ASK1）结合并抑制其K48连接的泛素化，从而增强ASK1蛋白稳定性并激活ASK1‐JNK/p38信号通路。USP11对CIRI的促进作用依赖于其对ASK1的调控。该研究为CIRI的防治提供了新靶点，靶向USP11‐ASK1‐JNK/p38‐铁死亡轴可能成为预防和治疗CIRI的新策略。
三、主要技术方法
研究人员采用了以下关键技术方法：建立USP11基因敲除（USP11‐KO）小鼠和腺相关病毒9介导的USP11过表达（AAV9‐USP11）小鼠模型，通过短暂大脑中动脉阻塞（transient mid‐cerebral artery occlusion, t/MCAO）手术构建CIRI小鼠模型（小鼠购自武汉Whupenn生命科技有限公司和赣南创新与转化研究院）；分离培养新生SD大鼠原代皮层神经元，建立OGD/R细胞模型；利用USP11敲低和过表达腺病毒感染神经元进行体外功能研究；采用神经功能评分、TTC染色评估脑梗死体积；运用免疫荧光和免疫组织化学染色检测CD11b和F4/80阳性细胞；通过qRT‐PCR、Western blot检测基因和蛋白表达；使用商业化试剂盒检测丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量和谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）比值；通过免疫共沉淀（Co‐IP）验证蛋白相互作用；通过泛素化实验检测ASK1的泛素化水平；使用ASK1特异性抑制剂NQDI‐1进行体内外干预实验；使用铁死亡抑制剂Ferrostatin‐1和铁死亡激动剂Erastin验证铁死亡介导作用。
四、研究结果
USP11在CIRI期间表达上调：通过t/MCAO手术建立CIRI小鼠模型，RT‐PCR结果显示梗死区脑组织中炎症因子Tnf、Il6、Il1b mRNA水平显著升高，表明炎症被显著激活。进一步分析发现，t/MCAO组小鼠脑组织中USP11的mRNA和蛋白水平均上调。在OGD/R处理的神经元中，炎症相关因子Tnf、Ccl2、Ccl5 mRNA水平明显升高，USP11的mRNA和蛋白表达水平同样上调。这表明USP11在CIRI中的表达变化可能涉及转录水平的调控。
USP11缺失减轻CIRI期间的脑损伤、炎症和铁死亡：利用USP11基因敲除小鼠建立CIRI模型，结果显示USP11‐KO t/MCAO组的神经功能缺损显著轻于WT t/MCAO组，脑梗死体积显著减小。CD11b和F4/80阳性细胞数量显著减少，炎症因子Tnf、Il6、Il1b和趋化因子Ccl2的mRNA水平显著降低，NF‐κB信号通路关键分子磷酸化Ikkβ和p65表达降低，IkBα表达升高。USP11缺失还降低了脑组织中脂质过氧化物MDA含量，提高了GSH/GSSG比值，抑制了ACSL4蛋白水平并促进了GPX4蛋白水平。
USP11过表达加剧CIRI期间的脑损伤、炎症和铁死亡：通过侧脑室注射AAV9‐USP11建立USP11过表达小鼠模型，结果显示USP11过表达显著加剧t/MCAO手术引起的神经功能缺损和脑梗死。炎症反应增强，表现为CD11b和F4/80阳性细胞增多，Tnf、Il6、Il1b和Ccl2 mRNA表达上调，NF‐κB信号轴激活增强。MDA含量增加，GSH/GSSG比值降低，ACSL4蛋白水平升高而GPX4蛋白水平降低。
USP11通过铁死亡调控OGD/R诱导的神经元损伤和炎症：用不同细胞死亡抑制剂处理USP11过表达神经元，结果显示只有铁死亡抑制剂Ferrostatin‐1逆转了USP11过表达诱导的神经元损伤，而凋亡抑制剂Z‐VAD‐FMK和焦亡抑制剂Disulfiram无此作用。Ferrostatin‐1还逆转了USP11过表达引起的炎症相关基因上调、MDA含量升高、GSH/GSSG比值降低、ACSL4蛋白水平升高和GPX4蛋白水平降低。相反，铁死亡激动剂Erastin消除了USP11敲低对OGD/R诱导神经元损伤的保护作用，并取消了USP11敲低对炎症和铁死亡的抑制作用。
USP11在CIRI期间激活ASK1‐JNK/p38信号通路：Western blot结果显示，USP11缺失或过表达对ERK、JNK、p38总蛋白水平和ERK磷酸化水平无显著影响，但USP11缺失显著降低JNK和p38的磷酸化水平，USP11过表达则显著增加其磷酸化水平。进一步研究发现，USP11缺失显著降低ASK1的总蛋白和磷酸化水平，USP11过表达则增加ASK1的总蛋白和磷酸化水平，而对TAK1和TPL2无显著影响。
USP11通过ASK1‐JNK/p38信号通路加剧OGD/R刺激的神经元损伤、炎症和铁死亡：使用ASK1抑制剂NQDI‐1处理USP11过表达神经元，结果显示NQDI‐1逆转了USP11过表达对ASK1‐JNK/p38信号轴激活的促进作用，改善了USP11过表达引起的细胞损伤，消除了USP11过表达对神经炎症的促进作用，并取消了USP11过表达对神经元铁死亡的促进作用。
USP11通过ASK1‐JNK/p38信号通路加剧CIRI：体内实验中，侧脑室注射NQDI‐1抑制了USP11过表达引起的ASK1‐JNK/p38信号轴激活，消除了USP11过表达对神经功能缺损和脑梗死的加速作用，逆转了USP11过表达引起的炎症因子mRNA水平升高和CD11b、F4/80阳性细胞浸润增加，并取消了USP11过表达引起的MDA含量升高、GSH/GSSG比值降低以及ACSL4和GPX4蛋白水平的变化。
USP11与ASK1相互作用并抑制其K48连接泛素化：免疫共沉淀实验证实USP11和ASK1可相互结合，且在OGD/R刺激的神经元中也存在相互作用。结构域定位实验表明，USP11的C末端（301‐963aa）与ASK1的N末端（1‐678aa）相互作用。泛素化实验显示，USP11抑制ASK1的泛素化，且特异性地抑制ASK1的K48连接泛素化。使用K48O和K48R突变体进一步证实了USP11对ASK1 K48连接泛素化的抑制作用。缺失ASK1相互作用结构域的USP11突变体丧失了去泛素化ASK1的能力，也失去了对ASK1‐JNK/p38通路和铁死亡相关蛋白ACSL4、GPX4的调控作用，以及对神经元活性、MDA含量和GSH/GSSG比值的影响。此外，去泛素化酶活性位点突变的USP11不能增强ASK1‐JNK/p38信号轴的激活。
五、讨论与结论
讨论部分指出，该研究首次证实了USP11在CIRI中的功能与机制。USP11在多种疾病中过表达并促进疾病进展，本研究发现在CIRI模型中USP11在mRNA和蛋白水平均上调，提示其表达涉及转录水平调控，但上游调控因子尚需进一步研究。铁死亡过程中积累的脂质过氧化物可直接激活单核/巨噬细胞中的炎症通路，促进促炎细胞因子分泌和细胞募集，而USP11介导的神经元铁死亡可能通过释放脂质过氧化物等信号分子激活单核/巨噬细胞和NF‐κB通路，驱动神经炎症。该研究还首次证明USP11可促进ASK1‐JNK/p38信号轴激活，通过抑制ASK1的K48连接泛素化增强ASK1蛋白稳定性，从而发挥加重CIRI的作用。研究存在一定局限性，包括CIRI在人类中是否存在及程度尚存争议、炎症的具体类型和其他信号通路的参与尚待确定、使用全身性USP11敲除小鼠无法明确USP11在神经元中的特异性作用、部分实验样本量较小等。
研究结论为：USP11在CIRI期间表达增加，USP11的缺失或敲低可阻止CIRI进展，而过表达则促进其发展。USP11对CIRI的促进作用是通过抑制ASK1的K48连接泛素化实现的。该研究为CIRI的预防和治疗提供了新靶点，也为改善IS患者预后的治疗方法和药物开发提供了新思路。
