《Food and Function》：Impact of fermentation on the bioaccessibility and bioactivity of xanthophylls (lutein and zeaxanthin) in selected fruits and vegetables: an in vitro Caco-2 studyOpen Access
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叶黄素（lutein）和玉米黄质（zeaxanthin）是类胡萝卜素（carotenoids），在维持眼睛健康方面发挥着重要作用，且由于人类无法从头（de novo）合成它们，必须从膳食来源获取。然而，它们在食物中的浓度通常非常低。本研究评估了发酵在增强十二种
叶黄素（lutein）和玉米黄质（zeaxanthin）是类胡萝卜素（carotenoids），在维持眼睛健康方面发挥着重要作用，且由于人类无法从头（de novo）合成它们，必须从膳食来源获取。然而，它们在食物中的浓度通常非常低。本研究评估了发酵在增强十二种常见食用果蔬中叶黄素类（xanthophylls）生物可及性（bioaccessibility）方面的作用。此外，研究还调查了生鲜及发酵羽衣甘蓝（kale）和玉米（corn）中这些化合物的细胞摄取（cellular uptake）及生物活性（bioactivity），这两种作物含有可检测水平的叶黄素和玉米黄质。经过五天的自然发酵（spontaneous fermentation），发酵蔬菜中叶黄素和玉米黄质的含量增加了30–50%。同样，羽衣甘蓝和玉米中这些化合物的细胞摄取分别增加了35%和38%。发酵羽衣甘蓝和玉米在Caco-2细胞中响应诱导的炎症和氧化应激时，细胞因子（cytokine）产生减少了45–50%，表明其抗炎（anti-inflammatory）和抗氧化（antioxidant）特性得到增强。全长16S rRNA测序（16S rRNA sequencing）显示，肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和混淆魏斯氏菌（Weissella confusa）是发酵玉米和羽衣甘蓝中的优势细菌。在使用从各自自然发酵样品中分离的细菌对羽衣甘蓝和玉米进行受控发酵（controlled fermentation）时，观察到叶黄素和玉米黄质的一致增加，这进一步支持了自然发酵和受控发酵在增强植物性食品中叶黄素类方面的有益作用。
发酵增强果蔬中叶黄素类生物可及性与生物活性的机制研究：基于体外Caco-2细胞模型的系统评价
一、研究背景与意义
类胡萝卜素是一类由植物、藻类及部分光合微生物产生的亲脂性萜类色素，其共轭双键结构赋予了这些化合物重要的抗氧化和抗炎特性，在预防心血管疾病、2型糖尿病等慢性疾病以及维护眼睛健康方面具有广泛的研究证据。根据分子结构，类胡萝卜素可分为不含氧的胡萝卜素类和含氧的叶黄素类。叶黄素、玉米黄质和中位玉米黄质是主要的叶黄素类化合物，因在视网膜中浓度较高而统称为黄斑色素。大量证据表明，这些黄斑色素能够过滤光毒性短波长蓝光，保护眼睛免受年龄相关性黄斑变性及其他眼部疾病的侵害。此外，近期研究还报道了黄斑色素在大脑中的存在及其在维持老年人认知功能和支持婴儿大脑发育方面的作用。
年龄相关性黄斑变性是全球老年人群视力丧失的主要原因。由于干性黄斑变性目前尚无治疗方法，预防策略至关重要。富含黄斑色素的膳食和补充剂已被报道可减缓疾病进展。然而，食物中黄斑色素的含量通常很低。生物可及性是指类胡萝卜素在消化过程中从食物基质中释放并可被肠道吸收的比例，是生物利用度的先决条件。类胡萝卜素的生物可及性受食品加工方式、食物基质、消化过程和肠道吸收等多种因素影响。
以往研究表明，均质化和热处理等食品加工方式对类胡萝卜素的生物可及性有积极影响。在众多食品加工技术中，发酵具有改善食品营养和感官特性的潜力。已有研究报道乳酸菌发酵可增加番茄浆中番茄红素和β-胡萝卜素的含量，传统发酵方法也能提高β-胡萝卜素含量。然而，关于自然发酵和受控发酵对完整果蔬中类胡萝卜素（特别是叶黄素和玉米黄质）生物可及性和生物活性的作用，目前几乎没有信息。
鉴于对发酵如何影响完整食物中叶黄素类生物可及性的了解有限，本研究旨在评估自然发酵对十二种广泛食用果蔬中叶黄素和玉米黄质生物可及性的影响。此外，利用体外Caco-2细胞模型研究了新鲜和发酵羽衣甘蓝和玉米中叶黄素和玉米黄质的细胞摄取及生物活性（特别是抗氧化和抗炎特性）。研究还通过16S rRNA测序分析了发酵羽衣甘蓝和玉米的微生物多样性，以鉴定优势微生物种类，并从自然发酵样品中分离优势细菌进行受控发酵，进一步评估叶黄素和玉米黄质的释放和胶束化组分。
二、主要技术方法
研究人员采用了多种关键技术方法开展研究。样品来源方面，新鲜羽衣甘蓝和玉米购自澳大利亚悉尼当地超市。主要技术包括：自然发酵和受控发酵工艺（添加2.5%食盐，在21°C和55%相对湿度条件下发酵五天）；模拟胃肠道消化系统（使用人工肠道消化器，依次进行唾液相、胃相和肠相消化，收集胶束化组分）；人结肠癌Caco-2细胞模型（用于细胞摄取、跨膜转运及抗炎抗氧化活性评价）；高效液相色谱和液相色谱-质谱联用技术（用于类胡萝卜素的定性和定量分析）；全长16S rRNA测序（通过澳大利亚基因组研究机构完成，使用PacBio Revio平台）用于微生物多样性分析；以及乳酸菌分离纯化技术用于受控发酵的菌种制备。
三、研究结果
3.1 发酵周期优化
研究人员监测了羽衣甘蓝和玉米在一周发酵过程中的pH值和可滴定酸度。结果表明，两种样品的pH值均从初始约6.0降至4.2以下，可滴定酸度随发酵时间持续增加。pH低于4.5被认为是发酵食品的最佳状态，这主要源于乳酸菌在自然发酵过程中从糖类产生有机酸。低pH环境还能抑制潜在致病菌和腐败菌的生长，从而提高食品的安全性和保质期。
3.2 发酵对叶黄素和玉米黄质含量的影响
通过高效液相色谱分析，研究人员测定了新鲜和发酵玉米及羽衣甘蓝中叶黄素和玉米黄质的含量。玉米经五天发酵后，叶黄素含量从160.80增至216.43 μg/g干物质，增加34.60%；玉米黄质含量从22.15增至37.65 μg/g干物质，增加69.97%。羽衣甘蓝经五天发酵后，叶黄素含量从1367.80增至1615.50 μg/g干物质，增加18.10%；玉米黄质含量从151.65增至192.50 μg/g干物质，增加27.00%。值得注意的是，第七天的增加量与第五天相比无显著差异，表明五天是获得最佳叶黄素和玉米黄质水平的适宜发酵时长。玉米黄质的增幅（25–50%）高于叶黄素（18–35%）。
3.3 其他果蔬的发酵验证
研究人员进一步对另外十种果蔬进行五天自然发酵。所有发酵样品的pH值均从约6.5降至约3.5，可滴定酸度平均增加至1.5%。大多数蔬菜中叶黄素含量高于玉米黄质，仅红椒、橙椒和红辣椒等少数蔬菜的玉米黄质含量更高。所有发酵果蔬的叶黄素和玉米黄质含量均有所增加，但增幅因样品而异。其中黄椒的叶黄素增幅达93.38%，韭葱的叶黄素增幅达111.71%，雪豌豆的玉米黄质增幅达146.73%。研究人员认为，增幅差异可能与不同乳酸菌对不同底物的适应性以及细胞壁破坏程度有关。
3.4 受控发酵
16S rRNA测序结果显示，自然发酵五天的玉米以肠膜明串珠菌和植物乳植杆菌为优势菌，而发酵羽衣甘蓝则以乳酸乳球菌和混淆魏斯氏菌为主。研究人员从自然发酵样品中分离纯化乳酸菌，经16S rRNA分析确认为混淆魏斯氏菌（来自羽衣甘蓝）和植物乳植杆菌（来自玉米），并用于受控发酵。受控发酵玉米三天后，叶黄素和玉米黄质含量分别增加34%和304%；受控发酵羽衣甘蓝后，叶黄素和玉米黄质含量分别增加58%和45%。由于目前没有证据表明乳酸菌能够合成类胡萝卜素，研究人员认为这种增强更可能归因于乳酸菌引起的细胞壁破坏，从而促进了这些类胡萝卜素的释放。
3.5 消化生物可及性
研究人员通过模拟胃肠道消化评估了叶黄素和玉米黄质的消化生物可及性（胶束化率）。发酵样品的叶黄素类生物可及性显著高于新鲜样品。玉米经五天发酵后，叶黄素的消化生物可及性从15.712增至44.45 μg/g干物质，增加182.90%；玉米黄质从12.29增至29.47 μg/g干物质，增加139.79%。羽衣甘蓝经五天发酵后，叶黄素的消化生物可及性从164.70增至568.38 μg/g干物质，增加245.10%；玉米黄质从24.34增至50.566 μg/g干物质，增加107.75%。在受控发酵条件下，玉米中叶黄素和玉米黄质的胶束化组分分别增强93%和122%，羽衣甘蓝中分别增强248%和301%。在大多数样品中，叶黄素的消化生物可及性高于玉米黄质，这可能与叶黄素较高的极性及其在叶绿素降解后更易释放有关。
3.6 肠道生物可及性
利用Caco-2细胞单层模型，研究人员评估了叶黄素和玉米黄质的细胞摄取和跨膜转运。发酵样品的叶黄素和玉米黄质在顶侧室浓度、细胞摄取和基底侧转运量方面均显著高于新鲜样品。羽衣甘蓝发酵五天后，叶黄素的细胞摄取从17.52增至54.80 ng/mL，玉米黄质从2.15增至5.35 ng/mL。玉米发酵后，叶黄素的细胞摄取从1.15增至5.14 ng/mL，玉米黄质从0.96增至3.05 ng/mL。发酵羽衣甘蓝中叶黄素和玉米黄质的转运率分别为50%和43%，发酵玉米中分别为53%和47%，均高于以往研究报道的纯化合物转运率。
3.7 细胞抗炎和抗氧化活性
研究人员以IL-8细胞因子浓度作为生物标志物，评估了样品消化物的抗炎和抗氧化特性。在TNF-α诱导炎症和H?O?诱导氧化应激的Caco-2细胞模型中，所有测试样品均降低了IL-8的产生。发酵羽衣甘蓝和玉米对IL-8浓度的降低程度显著大于新鲜样品，表明发酵增强了抗炎和抗氧化特性。研究人员将这种增强归因于叶黄素和玉米黄质细胞摄取的增加以及乳酸菌产生的具有抗氧化和抗炎特性的生物活性代谢物。
3.8 微生物多样性
16S rRNA测序分析显示，自然发酵和受控发酵均能有效抑制潜在病原菌的生长。受控发酵中乳酸菌丰度更高，可能增强了细胞壁破坏作用并减少了竞争性微生物种群，从而限制了这些类胡萝卜素的利用。肠膜明串珠菌和乳酸乳球菌已被报道具有抗氧化和抗炎活性，其抗氧化机制包括自由基清除、脂质过氧化抑制、金属螯合和多种抗氧化酶功能。乳酸菌的抗炎特性归因于其产生的胞外多糖和短链脂肪酸，这些物质可促进肠上皮再生并帮助损伤恢复。
四、讨论与结论
本研究系统证明了自然发酵和受控发酵均能显著提高多种果蔬中叶黄素和玉米黄质的含量、消化生物可及性、细胞摄取率以及抗炎和抗氧化生物活性。发酵增强叶黄素类生物可及性的机制主要归因于乳酸菌对植物细胞壁和细胞器结构的破坏作用，促进了类胡萝卜素从食物基质中的释放及其在肠道消化过程中向混合胶束的掺入。发酵过程中pH降低、叶绿素含量减少以及乳酸菌代谢产物的产生也可能共同促进了这些效应。本研究为开发基于发酵技术的功能性食品以增强黄斑色素的膳食摄入提供了科学依据，对预防年龄相关性黄斑变性等眼部疾病具有重要的应用价值。未来研究可进一步探索不同乳酸菌菌株对特定果蔬基质中叶黄素类释放的差异化影响，以及体内条件下发酵食品中叶黄素类的生物利用度和健康效应。
