负载白藜芦醇的丝胶蛋白-弹性蛋白纳米共混物用于cosmeceutical应用：理化稳定性、包封及HaCaT细胞抗氧化保护

《International Journal of Pharmaceutics》：Development of sericin-elastin nanoblends containing resveratrol for cosmeceutical applications

　　

开发了生物相容性（biocompatible）丝胶蛋白（sericin）/弹性蛋白（elastin）纳米共混物（nanoblends），用于递送白藜芦醇（resveratrol，RSV）。纳米颗粒（140 nm）在不同pH和温度下表现出高稳定性。制剂在人HaCaT角质形成细胞（human keratinocytes）上表现出优异耐受性。负载RSV的纳米共混物增强了对皮肤氧化应激（oxidative stress）的细胞保护（cytoprotection）作用。

近年来，护肤产业与皮肤病学、药理学及制药技术加速融合，形成药妆品（cosmeceuticals，兼具化妆品与生物活性药物功能的皮肤外用产品）领域。该领域需求集中于靶向防治光老化（photoaging）、色素沉着，并提供抗衰和保湿效益，同时利用抗氧化、抗炎生物活性物管理感染和炎症状态。皮肤虽具有内源性抗氧化防御系统，但紫外线可破坏该生物屏障，自由基产生后导致氧化应激（oxidative stress），成为光老化主要驱动因素，促进皱纹、色素沉着甚至皮肤癌风险。抗氧化剂局部应用可清除自由基，但活性物化学不稳定、皮肤渗透差、光氧快速降解限制临床疗效。纳米技术通过脂质体、聚合物纳米粒、脂质载体等保护敏感化合物、调节释放并增强角质层渗透。天然聚合物因生物相容、可降解和环保而受关注。研究人员旨在开发天然蛋白基纳米共混物（nanoblends，不同聚合物在分子水平共组装形成单一均质基质的整体胶体系统）用于药妆品，递送抗氧化化合物，并支持废弃物到财富和循环经济。丝胶蛋白（sericin）是蚕丝脱胶副产物中的球状蛋白，具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗炎、组织修复、抗紫外、抑制弹性蛋白酶和保湿等特性。弹性蛋白（elastin）是细胞外基质结构蛋白，与微纤维共组装赋予皮肤柔韧性和回弹。此前天然可溶性弹性蛋白与丝胶组合尚未探索。白藜芦醇（resveratrol，RSV）来自酿酒副产物，属于一般公认安全（GRAS，generally recognized as safe）物质，具有抗氧化、抗炎和细胞保护作用，可调节MAP激酶、核因子κB（NF-κB）和基质金属蛋白酶（MMPs）等通路，但局部应用受不稳定、水溶性差和光氧降解限制。

关键技术方法（≤250字）：采用去溶剂化法（desolvation method）制备弹性蛋白纳米粒，并将弹性蛋白（2 mg/mL）与丝胶（1–5 mg/mL）共组装为纳米共混物；以RSV（0.2–0.8 mg/mL）为模型活性物，超速离心纯化。以光子相关光谱（PCS）测粒径、多分散指数（PdI）和Zeta电位，考察pH 4、7、10及32、37、50 °C；冻干时加入葡萄糖、海藻糖、蔗糖、甘露糖或甘露醇（5%或10% w/v），以重分散指数（RDI）评价。紫外分光光度法测包封率（EE%）；透析法在pH 7.4和5.5测释放，并用零级、一级、Higuchi和Korsmeyer-Peppas模型拟合；傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和Rose bengal（RB）法测表面性质；DPPH法测抗氧化活性并用Chou-Talalay法计算组合指数（CI）和剂量减少指数（DRI）；以HaCaT人角质形成细胞（购自CYTION）进行MTT、H₂O₂应激、CellROX和MitoSOX实验。

3.1 纳米系统的理化表征：通过去溶剂化法制备弹性蛋白纳米粒，2 mg/mL聚合物平均粒径约250 nm，PdI<0.3，Zeta电位接近零，静电稳定性差。多种稳定剂未改善尺寸和PdI，仅1.25% w/v Tween 80尺寸合适但Zeta近中性。改用丝胶-弹性蛋白纳米共混物后，丝胶1–5 mg/mL使粒径和PdI显著下降，Zeta电位降至约?35 mV；5 mg/mL丝胶导致宏观聚集体和沉淀。选4 mg/mL丝胶与2 mg/mL弹性蛋白为理想条件。

3.2 pH和温度影响：酸性pH 4时平均粒径增至327±20 nm，PdI 0.3±0.1，Zeta电位?7±2 mV，可能与接近丝胶等电点3.5有关。pH 7时粒径接近初始值，Zeta电位从?35 mV变为约?10 mV，反映构象重排和部分自组装，预期促进水解弹性蛋白链疏水缔合及丝胶向β-sheet有序构象重排。pH 10时粒径略增、PdI显著增大，Zeta绝对值降低。32和37 °C下纳米共混物保持140–150 nm，PdI由0.18升至0.23，胶体稳定性良好；50 °C参数强烈增加，归因于热诱导蛋白基质结构重排，Zeta电位无显著变化。

3.3 纳米系统冻干：无冷冻保护剂冻干导致粒径和PdI大幅增加，RDI为308±5%。保护剂呈浓度依赖，低于10% w/v保护不足。10%甘露醇唯一保持系统完整性和重分散性，RDI最低为155±7%，粒径由约140 nm变为约220 nm，PdI由0.20变为0.21，Zeta电位由?35 mV变为?24 mV。甘露醇相分离和结晶形成刚性固体基质，间质通道物理隔离无定形相，颗粒间网络增加冻干饼微结构不连续，有利于复溶润湿。

3.4 载RSV纳米共混物的理化表征：RSV 0.2–0.8 mg/mL中，低于0.6 mg/mL不显著改变粒径和PdI；较高浓度导致粒径约500–700 nm、PdI约0.4–0.6。0.4 mg/mL为理想用量。Zeta电位为负，RSV对胶体表面结构影响低。

3.5 RSV包封效率和释放曲线：0.2和0.4 mg/mL RSV的EE%相近，约30%。0.2 mg/mL载药量为0.06 mg/mL，0.4 mg/mL载药量为0.12 mg/mL，后者高2倍。上清UV-Vis光谱与天然RSV一致，无新峰或位移，约70%未包封活性物化学完整。冻干后EE%无显著差异。pH 7.4释放呈双相：初期突释归因于表面吸附药物脱附和溶解，随后缓释；低RSV初释更快，高RSV初释稍慢后趋势相似。pH 5.5下前6 h累计释放约90%，有利于局部即时抗氧化并减少摩擦或冲洗损失。Higuchi模型最适合，r²值支持基质扩散，符合Fick定律和时间平方根依赖。研究人员提出机制假设：表面脱附后，弹性蛋白和丝胶密集网络作为空间屏障，水渗透诱导水化和聚合物链松弛，RSV经曲折通道扩散，无过早侵蚀。

3.6 FT-IR光谱和杂化纳米粒表面性质评价：弹性蛋白在3286 cm^?1有N–H伸缩，酰胺I在1633 cm^?1，酰胺II在1519 cm^?1，酰胺III在1236 cm^?1；丝胶在3273 cm^?1有O–H，酰胺I在1636 cm^?1，酰胺II在1518 cm^?1，酰胺III在1239 cm^?1。共混纳米粒中酰胺II移至1529 cm^?1，酰胺I微移至1637 cm^?1，表明弹性蛋白和丝胶多肽链间分子间氢键和构象重排，确认形成共聚网络。RSV有3177 cm^?1 O–H及1582、1509、1440、1461 cm^?1芳香/二苯乙烯特征峰。载RSV共混纳米粒中这些峰强度下降或消失，O–H移至3270 cm^?1，酰胺II移至1515 cm^?1；物理混合物中RSV芳香振动仍明显，说明分子包埋由酚羟基与蛋白肽骨架间氢键驱动。RB法显示弹性蛋白纳米粒疏水性约为zein纳米粒的45%；丝胶使空纳米共混物更亲水，显著低于弹性蛋白纳米粒，提示自组装中丝胶亲水域朝外，部分屏蔽核内水解弹性蛋白疏水域。加入RSV未显著改变表面性质。

3.7 纳米共混物细胞毒性：HaCaT人角质形成细胞中，丝胶在100 μg/mL内细胞活力>90%。弹性蛋白和杂化纳米粒在48 h、最高浓度50–100 μg/mL时活力略降但仍>70%，符合ISO 10993-5:2009非细胞毒性限，即活力降低超过30%才定义为细胞毒性。结果支持纳米共混物安全性。

3.8 抗氧化活性评价：H₂O₂诱导氧化应激后，游离RSV 0.5–5 μM使细胞活力为78%–85%；纳米包封RSV为80%–90%，5 μM时保护最强。空纳米共混物也有内在抗氧化活性，细胞活力65%–75%，对照约55%，与丝胶高极性残基和羟基参与直接清除自由基及螯合金属有关。DPPH实验中，纳米共混物呈剂量依赖内在抗氧化活性。RSV 10 μg/mL时，纳米包封清除率约63%，游离型约36%，约2倍。Chou-Talalay分析显示所有浓度CI<1，为协同作用；10 μg/mL时CI 0.35、DRI 3.00，表明包封后达到相同抗氧化效果所需RSV剂量降低3倍；50 μg/mL时CI 0.54、DRI 1.92；25 μg/mL时CI 0.92、DRI 1.15。研究人员指出，缺乏离体渗透数据，因此目前为临床前概念验证，未来需离体皮肤研究确认局部滞留和转化相关性。

3.9 细胞内和线粒体抗氧化活性：H₂O₂使CellROX荧光较未处理细胞增加约3倍。空纳米共混物显著降低ROS，说明蛋白基质直接贡献抗氧化反应。载RSV纳米共混物较游离RSV更显著降低胞内ROS，提示纳米共混物结构提高活性物胞内可用性和抗氧化功效，可能与内吞途径增强细胞摄取有关。MitoSOX实验中，H₂O₂使线粒体超氧化物荧光约为未处理细胞的14倍；空纳米共混物显著降低线粒体ROS；载RSV纳米共混物效果最明显，且显著优于游离RSV。结果再次证明活性物与蛋白载体的协同作用，支持其作为新型药妆品的应用依据。

讨论与结论：讨论部分强调，聚合物载体因可包封生物活性物并调节生物药剂学特征和治疗功效，在先进递送系统中占重要地位。本研究开发的可生物降解弹性蛋白-丝胶共混系统可包封抗氧化分子并用于潜在药妆品。市场对有机、生态友好和弹性蛋白基皮肤化妆品需求增长，2023年全球弹性蛋白部门价值14.3亿美元，预计2031年达23.4亿美元，复合年增长率6.5%；人口老龄化也推动天然聚合物抗衰治疗研发。丝胶因成膜、增强胶原产生和减少皱纹深度而具抗衰价值。该研究创新核心是设计弹性蛋白和丝胶聚合物基质，用于RSV包封和稳定，并利用蛋白基质结构、保湿和生物相容性与RSV抗氧化、抗炎和细胞保护潜力之间的协同。结合人角质形成细胞中优异生物相容性，这些纳米系统有希望用于先进局部制剂；未来可与水凝胶或乳膏等半固体制剂结合，以实现铺展性、功效和控释，用于皮肤氧化应激、光老化或组织再生。研究人员正在进行体外和离体皮肤渗透及体内药效实验，以确认其作为创新药妆品的合理性。结论部分翻译：近几十年来，聚合物和聚合物载体因其能够包封生物活性化合物并调节其生物药剂学特征和治疗功效，在先进药物递送系统发展中发挥主导作用。在本实验工作中，研究人员考察了开发由弹性蛋白和丝胶组成的可生物降解共混物系统的可能性，旨在包封抗氧化分子以用于潜在药妆品用途。该方法的相关性得到当前市场格局支持。消费者对皮肤健康和环境可持续性意识增强，推动对有机、生态友好和弹性蛋白基皮肤化妆品配方的强劲需求。近期市场数据表明，2023年全球弹性蛋白部门价值14.3亿美元，预计2031年达到23.4亿美元，复合年增长率6.5%。全球人口老龄化进一步放大市场扩张，刺激基于天然聚合物的高性能抗衰治疗研发。同时，丝胶因成膜能力、增强胶原产生和减少皱纹深度，被视为抗衰配方中精细活性成分之一。在此背景下，本研究开发的纳米系统不仅满足当前市场需求，也代表先进纳米技术解决方案。创新核心在于设计由弹性蛋白和丝胶组成的聚合物基质，专门用于白藜芦醇包封和稳定。该方法有效利用蛋白基质的结构、保湿和生物相容性与包封活性物的抗氧化、抗炎和细胞保护潜力之间的协同。这些发现及在人角质形成细胞中观察到的优异生物相容性，支持所述纳米系统作为先进局部制剂开发的有希望候选物。未来，这些纳米共混物可与水凝胶或乳膏等半固体制剂结合，以确保最佳铺展性、功效和活性化合物控释。这些系统可应用于皮肤氧化应激、光老化或组织再生。因此，研究人员正在进行额外实验，以评估杂化纳米系统在体外和离体模型中的皮肤渗透曲线，以及体内药理学功效测试，这些是确认所开发配方作为创新药妆品使用合理性的必要步骤。