心脏自身抗体生物标志物预测恰加斯心肌病严重程度：一项基于蛋白质组学与机器学习的研究

《JACC: Basic to Translational Science》：Identifying Cardiac Autoantibody Biomarkers that Predict the Severity of Chagas Cardiomyopathy

：恰加斯心肌病（Chagas cardiomyopathy，ChCM）是恰加斯病（Chagas disease，ChD）最严重的临床表现，但目前缺乏预测性生物标志物。本研究采用基于蛋白质组学的发现与验证工作流程，包括二维电泳联合质谱（2D-MS）及酶联免疫吸附试验（ELISA），在独立队列中验证候选抗原，并评估这些自身抗体区分ChCM不同临床分期及心脏传导异常的能力。研究共纳入123例受试者，包括62例血清学确诊的ChD患者（按临床分期分为A期、B1/B2期和C/D期）及61例对照（健康对照、Brugada综合征、致心律失常性右心室心肌病和缺血性心力衰竭患者）。通过2D-MS鉴定出8种候选心脏蛋白，经Western blot验证后，6种自身抗体（α-辅肌动蛋白-2（ACTN2）、ATP合酶F1亚基α（ATP5F1A）、α-烯醇化酶（ENO1）、热休克同源71 kDa蛋白（HSPA8）、肌球蛋白重链7（MYH7）和丙酮酸激酶M（PKM））被纳入ELISA分析。结果显示，6种心脏自身抗体均与ChCM严重程度相关；其中ENO1在区分A期与B1/B2期方面表现最佳（OR=1.88；95% CI：1.14-3.11），ACTN2在区分A期与C/D期方面具有最强效应（OR=3.1；95% CI：1.38-7.15），二者在预测心脏传导异常方面亦表现突出。6蛋白联合面板在区分A期与C/D期及传导异常方面分别达到AUC 0.84（95% CI：0.724-0.964）。四种机器学习算法（逻辑回归、支持向量机、随机森林和XGBoost）在区分非ChCM与ChCM时均表现出良好性能（AUC 0.87-0.89）。研究表明，心脏自身抗体可预测ChCM的严重程度及心脏传导异常；尽管结果令人鼓舞，仍需在更大规模、多样化的研究人群中验证以确认其临床实用性。

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一、研究背景与意义

恰加斯病（Chagas disease，ChD）是由原生动物寄生虫克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）引起的热带疾病，流行于拉丁美洲，每年导致超过8000人死亡。近年来，人类迁徙和气候驱动的媒介分布变化已将ChD传播至包括美国在内的另外23个国家。在拉丁美洲移民中，血清阳性率差异很大，在西班牙专业医疗环境中高达53.8%，在北美和欧洲为2%-4%。ChD通常于儿童期或成年早期获得，主要通过锥蝽昆虫介导的媒介传播，但也存在先天性、输血、移植和口服传播途径。该疾病分为急性期和慢性期，中间隔以漫长的潜伏期。急性期约持续8周，通常无症状（95%），寄生虫血症水平高，心脏受累罕见（1%），死亡率低（<5%）。不确定期反映了先天性和Th1型免疫反应对寄生虫的控制，使寄生虫血症维持低水平或检测不到长达数年（70%）。经过数年至数十年，23%-40%的慢性感染者发展为恰加斯心肌病（Chagas cardiomyopathy，ChCM），这是该疾病最严重和最常见的临床表现，也是疾病相关死亡的主要原因。

目前，检测抗克氏锥虫抗体的血清学试验对诊断ChD高度可靠（敏感性和特异性≥95%），但预测哪些无症状个体（A期）将进展为ChCM（B-D期）以及进展速度仍是一个重大挑战。这一挑战尤为重要，因为ChCM是过早死亡、心脏骤停、心力衰竭（heart failure，HF）和卒中的重要原因。当前的诊断和预后方法，包括动态心电图（electrocardiogram，ECG）、超声心动图、心脏磁共振成像和心内膜心肌活检，主要检测已确立的结构和功能异常，而非与ChCM进展相关的早期分子和免疫学变化。此外，这些手段在ChD流行的资源有限地区难以获得。现有的心血管生物标志物如肌钙蛋白和脑钠肽在ChCM中的预测价值有限。这些局限性凸显了对更敏感、更易获得的生物标志物的需求，以便在不可逆心脏损伤发生前识别疾病进展。

ChCM的进展由持续性克氏锥虫感染与宿主免疫反应之间的复杂相互作用驱动。克氏锥虫直接感染心肌细胞，细胞内复制可导致细胞损伤和破裂，释放寄生虫和宿主抗原至周围组织。持续感染与ChCM的存在和严重程度均相关。此外，慢性炎症反应改变心脏电生理，破坏间隙连接处的连接蛋白43，诱导线粒体功能障碍和纤维化，最终损害传导和心室功能。T细胞介导和体液自身免疫机制也被认为促进疾病进展。鉴于对ChCM免疫介导机制的兴趣日益增长，已在ChD患者中描述了多种心脏自身抗体。针对β1-/β2-肾上腺素能受体和M2-毒蕈碱受体的功能性自身抗体与自主神经功能障碍和心律失常发生相关。此外，针对结构和代谢蛋白的经典抗体，包括肌球蛋白重链7（myosin heavy chain 7，MYH7）、α-烯醇化酶（α-enolase，ENO1）、丙酮酸激酶M（pyruvate kinase M，PKM）和热休克同源71 kDa蛋白（heat shock cognate 71 kDa protein，HSPA8），已在疾病不同阶段被报道。尽管有这些发现，患者自身抗体的临床效用仍不确定，其与疾病严重程度和传导异常的相关性尚未得到一致证实。这些局限性凸显了评估更广泛的自身抗体特征及其作为ChCM进展生物标志物潜在应用的研究需求。

二、研究内容与结论

本研究旨在探讨抗心脏自身抗体谱是否可用于表征ChCM的疾病严重程度。研究人员在既往研究基础上，采用基于蛋白质组学的发现和验证工作流程：使用二维电泳联合质谱（2D-MS）鉴定候选抗原，随后在独立队列中通过酶联免疫吸附试验（ELISA）进行验证，并评估这些自身抗体区分ChCM不同临床分期和心脏传导异常的能力。通过该方法，研究人员鉴定出6种在ChCM不同分期中呈差异表达的抗心脏自身抗体。

该研究是一项横断面研究，涉及多个机构的患者招募和/或样本分析：巴西Dante Pazzanese心脏病研究所和心脏研究所（InCor）；波兰国家心脏病研究所；巴西北里奥格兰德联邦大学Onofre Lopes大学医院（UFRN）；以及加拿大多伦多病童医院（SickKids）。共纳入123例受试者。62例年龄18岁以上、两性、血清学确诊的ChD患者来自巴西圣保罗的Dante Pazzanese心脏病研究所和心脏研究所（InCor）。根据美国心脏协会和巴西心脏病学会的慢性ChCM指南进行分期：A期（不确定型）为无症状、血清学阳性、ECG和超声心动图正常的患者；B期代表早期心肌病，细分为B1（ECG异常但无超声心动图异常或症状）和B2（ECG和超声心动图均异常但无症状）；C期对应HF症状出现；D期为晚期HF，静息时即有症状。分析时将B1和B2期合并为早期心肌病，C和D期合并为重症心肌病。对照组包括10例Brugada综合征（BrS）患者（来自巴西心脏研究所）、10例致心律失常性右心室心肌病（ARVC）患者（来自波兰国家心脏病研究所）、21例既往心肌梗死伴左心室收缩功能障碍（左心室射血分数≤45%）患者（来自巴西UFRN），以及20例健康志愿者血清样本。

研究发现，6种心脏自身抗体（ACTN2、ATP5F1A、ENO1、HSPA8、MYH7和PKM）在ChCM不同分期中呈差异表达。ENO1在区分A期与B1/B2期方面表现最佳，ACTN2在区分A期与C/D期方面具有最强效应，二者在预测心脏传导异常方面亦表现突出。6蛋白联合面板在区分A期与C/D期及传导异常方面达到AUC 0.84。四种机器学习算法在区分非ChCM与ChCM时均表现出良好性能（AUC 0.87-0.89）。该研究首次证明，组合的自身抗体谱可与临床疾病的进展和恶化相关联，并为其提供强大的判别性能，支持将其用作疾病分层和临床管理的生物标志物。

三、关键技术方法

研究人员采用以下主要技术方法开展研究：1）二维电泳联合质谱（2D-MS）发现平台：将正常心室组织蛋白按等电点和分子量分离，转移至硝酸纤维素膜后与患者血清孵育，通过Western blot检测自身抗体结合蛋白，切取相应蛋白点进行液相色谱-串联质谱鉴定，并通过生物信息学资源（STRING、Gene Ontology、Human Protein Atlas、GeneCards）确认心脏特异性表达和功能关联；2）Western blot验证：使用来自Creative BioMart的重组蛋白对2D-MS鉴定的候选靶标进行免疫反应性验证；3）间接ELISA定量：在微孔板上包被重组蛋白，与患者血清孵育后以HRP标记二抗检测，测定450和600 nm吸光度，OD值经Min-Max方法归一化；4）统计分析与机器学习：采用Mann-Whitney U检验、卡方检验、方差分析或Kruskal-Wallis检验（Benjamini-Krieger-Yekutieli事后校正）进行组间比较；采用广义线性模型（logistic回归）和受试者工作特征（ROC）曲线分析评估判别能力，以Youden指数确定最佳截断值；应用四种监督机器学习算法（逻辑回归、支持向量机、随机森林和XGBoost）对样本进行分类，采用SMOTE处理类别不平衡，5折交叉验证调优超参数。样本队列来源包括巴西（Dante Pazzanese心脏病研究所、心脏研究所InCor、UFRN）、波兰（国家心脏病研究所）和加拿大（SickKids）的多中心队列。

四、研究结果

1. 1.
   患者临床特征：62例ChD患者按疾病严重程度分为3个临床组：A期（n=16）、B1/B2期（n=17）和C/D期（n=29）。总体平均年龄61.9±11.1岁，组间差异显著（P=0.014），54.8%为女性。心电图方面，右束支传导阻滞（RBBB）在B1/B2组和C/D组分别占37.5%和43.7%，左束支传导阻滞（LBBB）在两组均为25.0%。纽约心脏协会（NYHA）功能分级随疾病分期进展而恶化（P=0.030）。左心室射血分数（LVEF）在各分期差异显著（P=0.001），A组为67.0±3.8，B1/B2组为57.2±10.1，C/D组为28.7±6.2。
2. 2.
   2D凝胶电泳发现平台与Western blot验证：研究人员分析了4份血清样本（3份来自晚期ChCM（C/D期），1份来自中度疾病（B1/B2期）），在4份样本中均检测到10个一致位置的蛋白点。经质谱鉴定和质量控制（1%假发现率，≥2个独特肽段，>20%序列覆盖率）后，结合生物信息学分析确认了8个关键蛋白：α-辅肌动蛋白-2（ACTN2）、ACTG1、ATP合酶F1亚基α（ATP5F1A）、ENO1、HSPA8、MYH7、PKM和微管蛋白β链（TUBB）。这些蛋白与ATP代谢和肌节组织等关键生物学过程相关。对11个重组蛋白进行Western blot验证后，6个蛋白（ACTN2-1023H、ATP5F1A-2238H、ENO1-1814H、MYH7-8021H、HSPA8-069H和PKM-009H）具有清晰特异的免疫反应性，被选入后续ELISA分析。
3. 3.
   抗心脏抗体ELISA：针对6种蛋白的ELISA优化后，在健康对照与ChD患者之间观察到OD值统计学显著差异。ENO1在ARVC（P=1.0×10??）和HF（P=6.0×10??）中也表现出独特OD谱。对比不确定期（A期）与中度期（B1/B2）患者时，ENO1-1814H差异显著（P=0.0073）。A期与重症期（C/D）之间，ACTN2-1023H、ATP5F1A-2238H、ENO1-1814H、MYH7-8021H和PKM-009H均显示显著性（P值范围0.0016-0.0096）。B1/B2期与C/D期之间除ACTN2（P=0.023）外无显著差异。所有蛋白均显著区分A期患者与对照组。重症期（C/D）与BrS、ARVC和HF患者比较时，所有蛋白在所有比较中均观察到显著差异。
4. 4.
   跨ChD分期的抗心脏抗体面板：广义线性模型确定了区分临床分期的最佳截断点。ENO1-1814H在区分A期与B1/B2期方面具有统计学显著判别力（OR=1.88；95% CI：1.14-3.11）。ROC曲线分析显示，组合蛋白面板AUC最高（AUC：0.79；95% CI：0.632-0.963），其次为ENO1（AUC：0.76）和PKM（AUC：0.68）。除HSPA8-4712H外，所有蛋白均区分A期与C/D期，其中ACTN2-1023H效应最强（OR=3.1；95% CI：1.38-7.15）。在评估传导异常（AVB-2、RBBB和LBBB）时，ACTN2-1023H显示最高OR（OR=2；95% CI：1.13-3.53），其次为ENO1（OR=1.96；95% CI：1.22-3.17）。6蛋白联合面板在区分传导异常方面总体AUC达0.84（95% CI：0.724-0.964），ENO1和PKM单独AUC分别为0.79和0.76。
5. 5.
   机器学习预测恰加斯心肌病：6种靶向蛋白在非ChCM与ChCM两组间均显示统计学显著差异（P<0.001）。四种机器学习算法（LR、SVM、RF和XGBoost）均表现出相当的判别性能：SVM和RF达到最高AUC值0.89，LR和XGBoost均达0.87。准确率方面，SVM、RF和LR为79%（95% CI：0.578-0.929），XGBoost为70%（95% CI：0.489-0.874）。变量重要性在不同模型中有所差异：SVM模型中PKM和ENO1贡献最强，LR模型中ACTN2为最主要贡献者。ACTN2、PKM和ENO1在多个模型中被反复识别为最强贡献者，支持这些生物标志物区分ChCM与非ChCM的生物学相关性。

五、讨论与结论

讨论部分指出，ChD是拉丁美洲感染性心肌病的主要原因，造成大量发病率和死亡率，并日益被视为全球健康问题。研究人员鉴定出6种抗心脏自身抗体（ENO1、PKM、ACTN2、MYH7、ATP5F1A和HSPA8），其相对水平随ChCM恶化而增加，组合后对区分A期与B1/B2期和C/D期患者以及有无传导异常患者具有强大预测力。ENO1（一种在炎症刺激下转位至质膜的糖酵解酶）是区分A期与B1/B2期临床分期的最佳自身抗体，并能准确识别传导异常个体。PKM（参与糖酵解的第二个靶标）与ENO1表现相近，其预测力在区分A期与B1/B2期及正常ECG与传导阻滞方面几乎与ENO1相当。ACTN2（Z盘的主要交联蛋白）是晚期疾病的最强判别因子，最佳区分A期与C/D期。MYH7自身抗体对临床严重程度和传导异常均仅显示中度预测性能。ATP5F1A（ATP合酶α亚基）自身抗体对临床严重程度和传导异常的预测力较温和。HSPA8参与通过BAG3-HSPB8-HSPA8复合物清除受损肌原纤维蛋白，在ChD血清阳性个体中观察到对重组人HSPA8的反应性高于健康组。将传导阻滞视为心脏传导系统受累的单一表型时，显示出一致的判别性能和关联，这在ChCM中具有生物学合理性，因为纤维化和炎症损害房室结和希氏-浦肯野系统，促进传导障碍。

结论部分指出，本研究支持多靶点自身抗体面板作为ChCM分期和监测的血清学工具。ENO1、PKM和ACTN2是最有前景的靶标，在整个评估的临床谱中表现出优越性能。这些发现表明免疫学特征与疾病严重程度相关，为改善风险分层和更早临床干预提供了基础。将这些生物标志物纳入诊断算法有望增强慢性ChD的管理，并为ChCM自身免疫机制的进一步研究提供指导。