新型猪肥厚型心肌病模型中左心室结构、生理及转录组异常的综合表征

《JACC: Basic to Translational Science》：Left Ventricular Structural, Physiological, and Transcriptomic Abnormalities in a Novel Porcine Hypertrophic Cardiomyopathy Model

肥厚型心肌病（HCM）是最常见的常染色体显性遗传心血管疾病，患病率高达1/200。研究人员利用同源重组和体细胞核转移技术，构建了携带人类HCM致病突变MYH7 R403Q杂合敲入的尤卡坦小型猪模型。R403Q猪表现出与人类相似的心脏肥厚特征，包括室间隔增厚、左心房增大及左心室质量增加。组织学分析显示，突变猪心脏存在纤维化、心肌细胞排列紊乱、毛细血管密度降低及小动脉内膜增生。功能层面，R403Q猪心脏呈现收缩过度、舒张末期压力升高、β-肾上腺素能反应减弱及钙离子（Ca2+）敏感性增强。单次给予心肌肌球蛋白抑制剂MYK-581（马瓦卡姆滕类似物）可显著减轻收缩过度并改善舒张功能。此外，单细胞核RNA测序（snRNAseq）揭示心肌细胞和成纤维细胞的细胞状态分布发生改变，且促纤维化和促炎信号通路被激活。该大型动物模型为理解HCM的发病机制及评估新兴疗法提供了重要平台。

一、研究背景与研究意义

肥厚型心肌病（Hypertrophic Cardiomyopathy, HCM）是最常见的常染色体显性遗传性心血管疾病，人群患病率高达1/200。其病理特征表现为在无高血压等外源性刺激下出现心室肥厚，常伴有不对称性室间隔增厚、心肌纤维排列紊乱及间质纤维化。HCM患者年死亡率为1%-5%，死因主要包括心律失常、卒中及心力衰竭，同时也是竞技运动员猝死的主要原因之一。

1990年，首个导致HCM的基因突变——β肌球蛋白重链（MYH7）基因上的Arg403Gln（R403Q）替换被发现。此后，至少8个编码肌节蛋白的基因被证实与HCM相关，其中MYH7和心肌肌球蛋白结合蛋白C（MYBPC3）突变最为常见。尽管小鼠模型在阐明HCM表型的分子机制方面发挥了重要作用，但小鼠心率约为人类的10倍，每搏输出量仅约10微升（人类约75毫升），且小鼠心脏主要依赖快速α肌球蛋白重链亚型（由Myh6编码），这与人类心脏的生理特性存在显著差异。因此，建立更接近人类生理的大型动物模型对于推动转化研究和药物开发至关重要。

本研究旨在构建并系统表征携带MYH7 R403Q突变的尤卡坦小型猪模型，以更准确地模拟人类HCM的结构、功能及分子特征。选择R403Q突变的原因包括：MYH7突变占家族性HCM病例的30%-40%；R403Q是MYH7中最常见的致病突变之一；该突变外显率高（60%）、发病年龄早、心衰事件风险高，且在多种实验系统中已被广泛研究。该模型的成功建立将为基础机制研究和靶向治疗评估提供宝贵的转化工具。

二、主要关键技术方法

研究人员采用以下核心技术：利用同源重组技术在尤卡坦小型猪胎儿成纤维细胞中引入MYH7 c.1208 G>A点突变（对应p.R403Q），并通过体细胞核移植技术获得杂合子克隆雄性仔猪；对仔猪进行纵向表型分析至12月龄（相当于人类青年期），涵盖血清生物标志物检测、心电图、超声心动图、心脏磁共振成像（CMR）及有创血流动力学评估；采集心脏组织进行组织学染色、离体心肌纤维力学测定、批量组织RNA测序（RNAseq）及单细胞核RNA测序（snRNAseq）。

三、研究结果

1. 结构与功能异常符合HCM影像学特征

CMR显示R403Q猪室间隔厚度进行性增加，左心室质量（绝对值及经体重校正后）在6-12月龄时显著高于野生型（WT）。左心房面积在幼年和成年阶段均明显增大。幼年期R403Q猪左心室射血分数（LVEF）升高，呈现收缩过度，但随年龄增长LVEF降至与WT相当水平。右心室射血分数也随年龄下降。未观察到左心室流出道梗阻。

2. 心电图异常

R403Q猪出现T波峰末间期延长、QRS时限延长，6-12月龄时QTc间期亦延长，提示心律失常易感性增加。

3. 肌原纤维排列紊乱、间质纤维化及促纤维化/促炎通路激活

组织学染色显示R403Q猪心肌纤维排列紊乱评分约为WT的4倍，胶原沉积增多。促纤维化基因TGFβ1和TGFβ2 mRNA表达上调。心肌细胞核体积增大约50%。批量RNAseq通路分析发现一氧化氮产生通路激活程度最高，同时多个促炎经典通路（如补体系统、内皮素-1信号、IL-8信号等）显著上调，上游调控因子包括肿瘤坏死因子、干扰素γ及多种白细胞介素。

4. 心肌血管异常

R403Q猪心肌小动脉出现内膜增生，且与肥厚严重程度相关；存在血管周围炎症和小动脉血栓形成；毛细血管密度降低。对血管扩张剂的冠脉血流储备受损。血浆肌钙蛋白I持续升高，提示慢性心肌缺血损伤。

5. 离体肌纤维钙敏感性、僵硬度和横桥动力学的年龄依赖性变化

1月和3月龄R403Q猪心肌去膜纤维的pCa₅₀升高（钙敏感性增加），Hill斜率降低（协同性下降），但9月龄时恢复正常。最大张力在3月和9月龄时降低。初始僵硬度和松弛时僵硬度在9月龄时下降，但僵硬/张力比随年龄进行性升高。横桥再结合速率（K_tr）在R403Q纤维中保持稳定，而WT纤维随年龄下降。

6. 体内肌丝动力学与功能储备改变

6月龄以下R403Q猪呈现收缩过度（收缩末期弹性、前负荷招募每搏功及LVEF升高），同时存在舒张功能障碍（舒张末期弹性、充盈压及Ded升高），血浆脑钠肽（BNP）水平升高。多巴酚丁胺刺激下，突变猪的心指数、每搏功、每搏输出量、dP/dt_min、tau及Eed的反应均减弱，表明β-肾上腺素能功能储备受限。急性给予MYK-581可降低收缩过度指标并改善舒张功能，且对R403Q猪的LVEF和dP/dt_max抑制作用小于WT。

7. 单细胞核RNA测序揭示心肌细胞和成纤维细胞状态改变

snRNAseq鉴定出11种心脏细胞类型，与人类心脏高度一致。心肌细胞中，应激态CM3比例显著增加，而CM1比例减少。共发现339个基因在R403Q心肌细胞中表达失调，其中39个与人类全基因组关联研究中的心血管表型相关。MYH7/MYH6比值在R403Q心脏中显著升高（210 vs 50）。成纤维细胞中，4种细胞状态（FB1、FB1.3、FB2、FB4）的比例发生改变，共359个基因表达失调，其中FB2状态特异性上调SHROOM4、LTBP3、CORIN及TGF-β受体基因。

四、讨论与结论

该研究成功建立了首个允许纵向表型追踪至成年期的MYH7 R403Q猪HCM模型。该模型复现了人类非梗阻性HCM的核心特征：早期出现收缩过度、钙敏感性升高及舒张功能障碍，后期进展为正常或降低的收缩功能伴心室充盈压升高。心肌血管异常（毛细血管稀疏、小动脉重塑）导致的慢性缺血可能是心肌损伤和替代性纤维化的原因之一。MYK-581在体内首次证明可有效逆转HCM相关的血流动力学异常，为该类药物在非梗阻性HCM中的应用提供了机制依据。

snRNAseq数据首次来自基因工程HCM模型，揭示了心肌细胞向应激状态（CM3）的转变以及成纤维细胞状态的动态变化，为理解HCM的细胞异质性提供了新视角。与其他已报道的猪HCM模型相比（如MYH7 R453C、MYBPC3 R495Q等），R403Q模型具有更高的存活率和更温和的表型，使其成为长期机制研究和药物评价的理想平台。

研究结论： MYH7 R403Q猪模型成功再现了人类HCM的主要结构、组织病理、生理及分子特征，包括心室肥厚、心肌细胞排列紊乱、间质纤维化、收缩功能保留、冠脉微血管异常、传导系统重塑及能量代谢障碍。该模型还表现出进行性的心肌炎症和免疫激活。研究数据支持HCM的发病假说：疾病初期以收缩过度、慢性缺血、心肌紊乱、炎症和纤维化为特征，随后进展为正常或降低的收缩功能、心室充盈压升高及猝死风险增加。该模型在评估心肌肌球蛋白抑制剂MYK-581中展现了良好效用，为未来HCM乃至射血分数保留的心力衰竭的新型疗法研究提供了重要工具。