组蛋白去甲基化酶KDM5A在LMNA心肌病小鼠模型中被激活并具有致病性

《JACC: Basic to Translational Science》：Histone Demethylase KDM5A Is Activated and Pathogenic in a Mouse Model of LMNA-Cardiomyopathy

心力衰竭（heart failure, HF）是全球发病率和死亡率的主要原因。无论基础病因如何，HF的发生和发展具有几个标志性特征，包括线粒体功能障碍、代谢失调和肌节组成改变。这些病理变化常常先于或伴随广泛的分子重塑，影响心肌细胞结构和功能，并受表观遗传修饰调控。染色质/表观遗传变化的建立由组蛋白修饰酶网络介导，这些酶以位点和细胞类型特异性方式写入、读取和擦除组蛋白标记。尽管取得了进展，但在确定有效的表观遗传靶点和阐明不同调控因子如何驱动HF发病机制方面仍存在关键挑战。鉴于HF的异质性，定义其发病机制中的核心分子机制可以作为额外的治疗干预靶点。

组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化（H3K4^me3）是一种普遍存在的表观遗传标记，通常富集于活性基因启动子，是基因表达的決定因素。它由组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶动态调控。KDM5家族组蛋白去甲基化酶是JUMONJI家族进化保守成员，是H3K4甲基化状态的主要调节因子。KDM5家族蛋白催化去除H3K4^me3/2的甲基，从而作为基因表达的抑制因子，尽管也有证据支持其通过招募共调节因子参与转录激活。

研究人员最近发现，在人类HF样本和小鼠HF模型中，赖氨酸去甲基化酶5A（KDM5A）的表达和活性增加。然而，KDM5A在心力衰竭心肌细胞（cardiomyocytes, CMs）中激活的功能和生物学意义仍不清楚。因此，为了确定KDM5A在HF中的致病作用，研究人员使用了一个充分表征的HF小鼠模型，该模型通过心肌细胞特异性缺失Lmna基因生成（Myh6-Cre:LmnaF/F，即核纤层蛋白A/C-心肌病 [LMNA-CMP] 小鼠）。这些小鼠在出生后3至4周内过早死亡，出现严重心功能障碍，并增加心肌纤维化和凋亡。

研究结果显示，在LMNA-CMP中，心肌细胞中KDM5A蛋白水平升高，其涉及心脏结构和功能以及氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）的靶基因被抑制。在LMNA-CMP小鼠中心肌细胞特异性基因敲除Kdm5a可恢复涉及心脏结构和功能以及OXPHOS的基因和转录因子的表达。这些发现部分通过相应基因和转录因子位点的全基因组H3K4^me3甲基化增加得到证实。心肌分子重塑的部分恢复与存活期延长、心功能改善以及心肌纤维化和细胞死亡减少相关。因此，该研究揭示了KDM5A介导的表观遗传调控在HF中的线粒体稳态和心脏功能中发挥关键作用。

心力衰竭（HF）是全球范围内致病和致死的主要原因，其发生发展涉及线粒体功能障碍、代谢紊乱和肌节组成改变等共同特征。这些病理改变常伴随广泛的分子重塑，受到表观遗传修饰的调控。目前识别有效的表观遗传靶点并阐明不同调控因子驱动HF发病机制仍是关键挑战。组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化（H3K4^me3）是活性基因启动子常见的表观遗传标记，由KDM5家族去甲基化酶等动态调控。研究人员此前发现KDM5A在人类HF样本和小鼠HF模型中表达和活性升高，但其在心肌细胞（CMs）中的功能意义仍未知。本研究使用心肌细胞特异性Lmna基因敲除小鼠（Myh6-Cre:LmnaF/F，即LMNA-CMP模型）来确定KDM5A的致病作用。该模型表现为出生后3至4周内过早死亡、严重心功能障碍、心肌纤维化和凋亡增加。研究人员发现，LMNA-CMP心肌细胞中KDM5A蛋白水平升高，同时心脏结构和功能及氧化磷酸化（OXPHOS）相关靶基因被抑制；心肌细胞特异性敲除Kdm5a可恢复这些基因和转录因子的表达，部分通过全基因组H3K4^me3甲基化增加实现，并伴随生存期延长、心功能改善及纤维化和细胞死亡减少。该研究首次揭示KDM5A介导的表观遗传调控在HF线粒体稳态和心脏功能中的关键致病作用，为HF提供了潜在的表观遗传治疗靶点。

研究人员使用的主要关键技术方法包括：从Jackson Laboratory获取野生型C57BL/6J、Myh6-Cre和Kdm5a floxed小鼠，通过杂交构建心肌细胞特异性Lmna敲除（Myh6-Cre:LmnaF/F）、Kdm5a敲除（Myh6-Cre:Kdm5aF/F）及双敲除（Myh6-Cre:LmnaF/F:Kdm5aF/F）小鼠，样本涵盖P14-P21小鼠，每组约5-14只，雌雄并用。体内表型评估采用超声心动图、Kaplan-Meier生存分析；心肌细胞经Langendorff系统分离；蛋白水平用免疫印迹检测；转录组用RNA-seq分析；全基因组H3K4^me3分布用CUT&RUN检测；通路分析采用基因集富集分析（GSEA）和Ingenuity Pathway Analysis（IPA）；凋亡和纤维化分别用TUNEL染色和天狼星红染色评估。

**KDM5A在LMNA-CMP心肌细胞中被诱导且其靶基因被抑制**：通过免疫印迹分析全心脏裂解液、分离心肌细胞及核提取物，发现Myh6-Cre:LmnaF/F小鼠中KDM5A蛋白水平较野生型明显升高；定量PCR显示涉及OXPHOS、脂肪酸氧化（FAO）及雌激素相关受体（ERR）家族的KDM5A候选靶基因转录水平降低。

**Kdm5a缺失改善LMNA-CMP小鼠存活率和心功能**：构建心肌细胞特异性Kdm5a单敲除小鼠后，其存活、心功能和凋亡均无明显异常。在LMNA-CMP背景下敲除Kdm5a（Myh6-Cre:LmnaF/F:Kdm5aF/F），超声心动图显示左室收缩末径、舒张末径及舒张末径指数减小，短轴缩短率和射血分数显著提高；Kaplan-Meier分析显示中位生存期从24天延长至35天；同时心衰和心肌肥大分子标志物表达减弱。

**Kdm5a缺失减弱LMNA-CMP中的细胞凋亡**：RNA-seq的GSEA显示凋亡相关基因富集在Myh6-Cre:LmnaF/F心肌细胞中，Kdm5a缺失后该信号显著逆转。TUNEL染色显示LMNA-CMP心肌中凋亡核增多，而双敲除小鼠中明显减少。定量PCR和免疫印迹显示促凋亡蛋白Caspase-3（CASP3）、Bcl-2相关X蛋白（BAX）、Bcl-2相关死亡激动剂（BAD）和受体相互作用蛋白激酶3（RIPK3）在LMNA-CMP中升高，Kdm5a缺失后部分恢复。在P14早期阶段这些标志物未改变，提示细胞死亡是KDM5A靶基因失调的下游效应。

**Kdm5a缺失挽救Myh6-Cre:LmnaF/F小鼠心肌纤维化**：天狼星红染色定量胶原容积分数（CVF），LMNA-CMP小鼠CVF为9.8%±3.8%，而野生型约为1%，双敲除小鼠降至1.5%±0.85%。定量PCR显示Tgfb1、Tgfb2、Col1a1等促纤维化基因在LMNA-CMP中上调，Kdm5a缺失后显著减弱。

**Kdm5a缺失减弱LMNA-CMP中基因表达失调**：RNA-seq分析显示LMNA-CMP心肌细胞中有6,609个差异表达基因；Kdm5a缺失后1,905个基因表达改变，其中1,458个基因恢复正常表达水平。GSEA显示KDM5A靶基因在LMNA-CMP中被抑制，敲除后逆转；标志性通路分析显示OXPHOS和肌生成通路恢复，而炎症和上皮-间充质转化相关通路被抑制。IPA预测KDM5A、TP53和SMAD家族为受抑制的上游调控因子，ESRRA和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α（PGC1A）为被激活的上游调控因子。

**LMNA-CMP心肌细胞中H3K4me3标记的全基因组重新分布及Kdm5a缺失后的恢复**：CUT&RUN分析显示LMNA-CMP与野生型相比有444个富集和862个缺失的H3K4me3峰；Kdm5a缺失后1,425个位点发生改变，其中501个峰富集、924个峰缺失。恢复的H3K4me3峰富集于心肌收缩、心脏传导、代谢和核受体信号通路相关基因；减少的峰则与炎症、细胞外基质组织和纤维化相关。整合转录组与H3K4me3数据鉴定出189个基因在转录水平和启动子H3K4me3信号上均得到恢复，包括TBX5和ERR家族成员。

**LMNA-CMP中TBX5和ERR心脏及OXPHOS转录因子受抑制**：基因组浏览器轨迹显示Tbx5和Esrrg的启动子及顺式调控元件处H3K4me3富集在LMNA-CMP中减少，Kdm5a缺失后部分恢复。定量PCR证实Tbx5及其下游靶基因（Irx4、Hopx、Myl2、Tnni3等）和Esrrg及其靶基因（OXPHOS复合体及FAO相关基因）在P14早期即已下调，双敲除后恢复。这与先前在iPSC来源心肌细胞中KDM5抑制导致Tbx5、Esrra和Esrrg表达升高的数据一致。

讨论部分指出，KDM5A在多种HF模型和人类样本中再表达，提示其激活具有普遍性。KDM5A通过去除启动子区域H3K4^me3直接抑制TBX5和ESRRG/ESRRA等关键转录因子，进而抑制心肌结构和线粒体代谢程序。部分基因表达恢复未伴随可检测的H3K4^me3改变，可能反映KDM5A通过多蛋白复合物（如含RB1、Sin3B/NuRD）的非酶活性依赖功能。研究还推测，LMNA缺失可能通过影响RB1表达而稳定KDM5A并使其异常定位。由于成年小鼠中Kdm5a缺失耐受良好，KDM5A成为有吸引力的治疗靶点。研究结论可翻译为：这些发现将KDM5A确定为协调HF中病理转录程序（涵盖线粒体代谢、收缩功能和OXPHOS相关基因）的关键表观遗传调控因子；成年小鼠中Kdm5a缺失耐受良好，凸显了其抑制的治疗可行性；因此，该研究揭示了KDM5A是疾病进展的驱动因素，为LMNA-CMP及更广泛HF背景下的干预提供了合理途径。