无内毒素 Escherichia coli 工程化生物聚合物颗粒共递送多抗原亚单位疫苗诱导针对类鼻疽的保护性免疫

《Advanced NanoBiomed Research》：Synthetic Particulate Subunit Vaccines Co-Delivering Multiple Antigens Induce Protective Immunity Against Melioidosis

类鼻疽（melioidosis）由 Burkholderia pseudomallei 引起，是一种危及生命的疾病，也是一种潜在的生物战剂。目前尚无获批疫苗可用于预防。为满足这一未满足需求，研究人员对无内毒素 Escherichia coli 菌株进行生物工程改造，以组装包被 B. pseudomallei 候选疫苗抗原（如 LolC、Omp85、OmpW、TssM、BopA、BimA、Hcp 1、Hcp 2、Hcp 3 和 Hcp 6）的生物聚合物包涵体。这些基于生物聚合物颗粒（biopolymer particle，BP）的疫苗与安全的 poly(I:C) 佐剂配伍，用于 BALB/c 小鼠的肌内（intramuscular，IM）和鼻内（intranasal，IN）给药。疫苗安全，并诱导特异且强烈的抗体反应。此外，疫苗介导 Th1 和 Th2 细胞因子分泌。与对照组相比，接种组未见显著体重变化。在动物试验中，免疫小鼠通过腹腔（intraperitoneal，IP）途径接受致死剂量 B. pseudomallei 菌株 K96243 攻击。接受 BimA-BP-BopA 和 COM1（BimA-BP-BopA、LolC-BP-Hcp1 和 ME-BM-BP-83 候选疫苗的组合）的小鼠在攻击后存活，与空 BPs 相比，其肝脏和肺脏细菌负荷降低。

论文解读

研究背景与问题：类鼻疽（melioidosis）由 Burkholderia pseudomallei 引起，是危及生命的疾病，可通过摄入、吸入或皮肤接种污染颗粒或气溶胶获得。该菌为革兰阴性菌，存在于湿热国家表层水和土壤，尤其在澳大利亚北领地和东南亚，也偶见于温带和亚热带；人和动物均可感染。常见临床表现为社区获得性肺炎，菌血症是最常见微生物诊断。B. pseudomallei 对多种抗生素耐药，部分临床分离株对 trimethoprim-sulfamethoxazole 和 ceftazidime 等一线抗生素耐药，治疗选择有限，且 13%–23% 患者复发。全球估计每年约 165,000 例、89,000 例死亡，但 45 个流行国家可能低估。高风险人群包括 40–60 岁个体、建筑和农业工人、原住民和托雷斯海峡岛民，以及结核、类固醇治疗、恶性肿瘤、肾病、酒精中毒、糖尿病和免疫抑制者。该菌可在恶劣环境存活多年，美国 CDC 将其列为 B 类生物恐怖剂，美国和欧洲纳入应急准备。目前无 FDA 批准抗菌药用于暴露后预防或治疗，因此开发有效疫苗至关重要。尽管已有多种候选疫苗，但尚无获批类鼻疽疫苗；传统平台存在过敏、毒性、不稳定、弱免疫原性等限制，聚合物平台也受批次变异、装载有限、生产复杂、稳定性与可扩展性等限制。研究人员因此采用天然聚(3-羟基丁酸酯)（poly(3-hydroxybutyrate)，PHB）作为抗原载体，利用可生物工程化共价展示异源抗原的 PHB 合成酶（PhaC）和自组装生物聚合物颗粒（biopolymer particle，BP），设计并开发针对 B. pseudomallei 的多抗原/表位 BP 疫苗，并在两个动物试验中评估安全性和免疫原性。

关键技术方法：研究人员用 Bcepred、IEDB、ABCpred 预测 B/T 细胞表位，构建 pET-14b 系列质粒；在无内毒素 ClearColi BL21(DE3)（携带 pMCS69）中以 PhaC 为锚定蛋白一步生产抗原/表位包被 BPs，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（LC-Q-ToF-MS）、PHB 定量、Zeta 电位、粒径和透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）表征。动物为 6–8 周龄雌性 BALB/c 小鼠；第一试验每组 10 只、10 组，5 μg 抗原+20 μg poly(I:C)，IM 或 IN，第 0、14、28 天；第二试验每组 8 只、8 组，20 μg 抗原+20 μg poly(I:C)，IM，第 42 天 IP 攻击 4×10⁴ CFU K96243。伦理批准为 Griffith University AEC（GRIDD/13/22/AEC）和 The University of Western Australia AEC（2024/ET000018）。检测包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹、Bio-Plex Th1/Th2 细胞因子、热稳定性和方差分析（ANOVA）。

研究结果：
设计、生产与表征：此前研究提示 10 个候选抗原具疫苗潜力。研究人员通过生物信息学预测 26 个 B/T 细胞表位，将抗原/表位翻译融合至 PhaC 的 N 端和 C 端，在无内毒素重组 E. coli 中高产制造抗原/表位包被 BPs，纯度 77%–98.1%。SDS-PAGE 和 LC-Q-ToF-MS 确认融合蛋白分子量：空 BP 64.3 kDa、LolC-BP-Hcp1 109.3 kDa、ME-BM-BP-83 103.6 kDa、BP-TssM 97.8 kDa、BimA-BP-BopA 111.2 kDa、FliC-OmpA-BP 94.7 kDa。纯化 BPs 的 PHB 含量分别为空 BP 56%、ME-BM-BP-83 75.2%、LolC-BP-Hcp1 51.6%、FliC-OmpA-BP 43.7%、BimA-BP-BopA 72%、BP-TssM 75.6%。BPs 表面带负电，加 poly(I:C) 后负 Zeta 电位更强，平均粒径约 1 μm，粒径分布更窄。TEM 证实细胞内球形 BPs 生成及纯化后形态保持。

免疫原性：BALB/c 小鼠模型用于类鼻疽疫苗研究。研究人员将空 BP、FliC-OmpA-BP、LolC-BP-Hcp1、BP-TssM、ME-BM-BP-83、BimA-BP-BopA 与 Poly(I:C) 配伍，经 IM 和 IN 在第 0、14、28 天免疫。疫苗安全，未观察到体重、体况、警觉性或活动剧烈改变。ELISA 显示对照无 B. pseudomallei 抗原特异 IgG 和 IgG₁ 抗体；所有类鼻疽 BP 疫苗在第 42 天诱导抗原特异 IgG 和 IgG₁，高于第 21 天。LolC-BP-Hcp1 诱导 LolC 和 Hcp1 特异 IgG，第 21 天 EC₅₀ 约 4800，第 42 天增加约 5.5 倍，IgG₁ 趋势类似；其用于 COM1（BimA-BP-BopA 和 LolC-BP-Hcp1）、COM2（BimA-BP-BopA、LolC-BP-Hcp1 和 ME-BM-83）、COM3（BimA-BP-BopA、BP-TssM 和 ME-BM-83）、COM4（ME-BM-83、FliC-OmpA-BP、BimA-BP-BopA、BP-TssM 和 LolC-BP-Hcp1）时，第 42 天 LolC/Hcp1 特异 IgG 和 IgG₁ 显著高于第 21 天。其他疫苗也诱导 IgG/IgG₁。IN 途径诱导明显低于 IM。第 42 天所有疫苗诱导显著抗原特异 IgG_2a。免疫印迹用免疫小鼠混合血清检测到抗 FliC、OmpA、LolC、Hcp1、TssM、BimA、BopA 抗体，空 BP 和 poly(I:C) 血清无带。细胞因子方面，IM 免疫后第 29 天，所有佐剂化疫苗诱导较高 Th1 细胞因子（IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-2、GM-CSF）和 Th2 细胞因子（GM-CSF、IL-4、IL-5、IL-10），高于空 BP 和 Poly(I:C) 对照；第 42 天降低；IN 低于 IM。

热稳定性分析：类鼻疽抗原包被 BPs 在 4、25、37、50 °C 孵育 4 周后，粒径无显著差异；Zeta 电位总体无显著差异，第 4 周负电位略增；SDS-PAGE 目标蛋白带稳定，但第 3、4 周条带强度略降；ELISA 显示抗原性保留，但 37 和 50 °C 孵育后抗体结合略降。

保护性免疫诱导：研究人员选择抗体和细胞因子表现最佳的疫苗，采用优于 IN 的 IM 途径，以 20 μg 抗原和 20 μg Poly(I:C) 进行攻击试验。该剂量安全，接种组无显著体重差异。第 29 天，佐剂化疫苗诱导较高 Th1（IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-2）和 Th2（GM-CSF、IL-4、IL-5、IL-10）细胞因子，高于对照。第 42 天以 4×10⁴ CFU B. pseudomallei K96243 经 IP 攻击，观察 35 天。前 12 天，除 ME-BM-BP-83 外，所有疫苗组生存概率≥60%；佐剂对照 25 天内全部死亡。整个研究期内存活组为 BP、BimA-BP-BopA 和 COM1（BimA-BP-BopA、LolC-BP-Hcp1 和 ME-BM-BP-83），每组各 1 只小鼠存活 35 天。第 35 天处死存活鼠取脾、肝、肺定量，BimA-BP-BopA 和 COM1 降低肝和肺 CFU 负担，但脾 CFU 未降低。第 29 天总 IgG 反应显著高于 BP 对照，与免疫原性研究一致。

讨论总结与结论翻译：讨论部分指出，B. pseudomallei 可致危及生命感染但无获批疫苗。研究人员利用 BP 平台开发安全有效的类鼻疽候选疫苗。PHB 获美国 FDA 批准用于多种生物医学应用，其单体 3-羟基丁酸是人血天然成分；BPs 非免疫原性，无载体抑制，抗原包被 BPs 可进入抗原提呈细胞交叉呈递途径。作为可溶性亚单位疫苗替代，颗粒疫苗刺激强细胞和体液免疫。由于 B. pseudomallei 为革兰阴性兼性胞内菌，清除需强 Th1 反应，因此使用 Poly(I:C) 佐剂；Poly(I:C) 是强 Th1 诱导剂、人兼容佐剂，刺激 B 和 T 细胞免疫。无内毒素 ClearColi BL21(DE3) 可从源头消除内毒素，避免下游去除。粒径约 1 μm 小于 4 μm，适合递送；负 Zeta 电位和加 poly(I:C) 后更负，减少聚集。热稳定性有助于减少冷链依赖。体内 IM 免疫安全并诱导抗原特异体液和细胞免疫，IgG、IgG₁、IgG_2a 及 Th1/Th2 细胞因子提示平衡反应。BimA-BP-BopA 在诱导 Th1/Th2 细胞因子和 IgG 方面突出，并在致死攻击中存活，肝肺细菌负荷降低。空 BP 载体组的一定生存益处可能与颗粒配方和 Poly(I:C) 引起的短暂非特异免疫刺激有关，但该组无抗原特异抗体且存活动物无细菌清除。与既往等效 BALB/c K96243 攻击的蛋白疫苗研究相比，重组 LolC 加 MPL+TDM 佐剂有显著保护，重组 Hcp 加 Sigma 佐剂保护较差；荚膜多糖糖偶联疫苗更成功，CpG 寡脱氧核苷酸和 Freund's 佐剂也有保护报告。

结论翻译：在本研究中，研究人员成功应用基于 BP 的疫苗平台，通过可扩展、成本有效且一步式的生产过程，将多个保守抗原/表位展示于 BPs 上。所有疫苗构建体均常温稳定、安全且具免疫原性，可诱导抗原特异性免疫应答。诱导的细胞因子提示混合 Th1 和 Th2 免疫应答。疫苗候选 BimA-BP-BopA 和 COM1（BimA-BP-BopA、LolC-BP-Hcp1 和 ME-BM-BP-83 疫苗候选的组合）在致死剂量 B. pseudomallei 攻击中显示最佳存活结果，与空 BPs 相比肝和肺细菌负荷降低。诱导的免疫应答为体液和细胞介导，与针对 B. pseudomallei 的保护性免疫相关。需要进一步研究改进配方，以增强保护性免疫。