SEP15富含半胱氨酸结构域采用新型折叠：内质网伴侣UDP-葡萄糖:糖蛋白葡萄糖基转移酶的硒蛋白辅伴侣

《Journal of Biological Chemistry》：The cysteine-rich domain of SEP15, a selenoprotein co-chaperone of the ER chaperone, UDP-glucose:glycoprotein glucosyltransferase, adopts a novel fold

　　

靶向分泌途径的蛋白质参与众多生物学过程，但只有正确折叠后才能发挥功能。在内质网中，糖蛋白折叠由UDP-葡萄糖:糖蛋白葡萄糖基转移酶（UGGT）及其氧化还原酶伴侣——15 kDa硒蛋白（SEP15，又名SELENOF）调控。这两种伴侣之间的相互作用尚不清楚，限制了对它们功能的理解。SEP15由两个结构域组成：C端硫氧还蛋白样结构域（结构已报道，PDB 2A4H）和约50个残基的N端富含半胱氨酸结构域（CRD），后者结构未知。此处，研究人员报道了介导与UGGT相互作用的SEP15 CRD的NMR溶液结构。这些数据揭示该结构域在溶液中形成二聚体，并采用一种先前未描述的螺旋折叠，由C10-C42、C21-C43和C24-C39之间的三个二硫键稳定。此外，研究结果验证了UGGT/SEP15复合物的模型，并为未来研究其与糖蛋白底物的相互作用奠定了基础。

约三分之一的人类蛋白质组靶向分泌途径，在内质网（ER）腔中折叠，凝集素伴侣网络通过N-连接聚糖修饰辅助这一过程。UDP-葡萄糖:糖蛋白葡萄糖基转移酶（UGGT）能够再生单葡萄糖基化聚糖，使未正确折叠的糖蛋白重新进入钙联蛋白/钙网蛋白循环。SEP15是UGGT的硒蛋白辅伴侣，含有硒代半胱氨酸（Sec）残基的C-G-U活性基序，其N端富含半胱氨酸结构域（CRD）介导与UGGT的结合，但该结构域的结构长期未知。SEP15敲除小鼠表现为早发性白内障和肝脏氧化应激，表明其在ER蛋白质量控制中具有重要功能。为阐明SEP15与UGGT相互作用的分子基础，研究人员开展了本研究。

研究人员设计并表达了SEP15 CRD构建体（残基1-52），利用免疫共沉淀证实其与UGGT1结合。通过质谱（MS）确定二硫键配对模式，结合CS-Rosetta计算和核磁共振（NMR）波谱测定了CRD的溶液结构。结果显示CRD采用一种新型三螺旋折叠，由C10-C42、C21-C43和C24-C39三个二硫键稳定，并在溶液中形成亚微摩尔亲和力的二聚体。该结构验证了先前基于AlphaFold预测的UGGT/SEP15复合物模型，为理解SEP15在ER蛋白稳态中的作用和未来治疗干预设计奠定了基础。

主要关键技术方法包括：利用大肠杆菌SHuffle菌株表达重组CRD以促进二硫键正确形成；通过免疫共沉淀验证CRD与UGGT1结合；使用傅里叶变换离子回旋共振质谱（FT-ICR MS）和天然质谱分析二硫键模式及寡聚状态；基于NMR化学位移的CS-Rosetta计算筛选二硫键配对；通过异核多维NMR实验进行主链和侧链归属，并使用¹³C过滤/编辑NOESY鉴定分子间接触；最终用AriaWeb迭代计算溶液结构。免疫共沉淀实验使用了HEK293-6E细胞系过表达UGGT1和SEP15。

研究结果如下：

**CRD构建体设计与SHuffle细胞表达：**研究人员设计含残基1-52的CRD构建体，在SHuffle菌株中表达。尺寸排阻色谱（SEC）显示两个峰，其中高分子量组分具有良好分散的HSQC谱，为折叠状态；低分子量组分谱线宽且分散差，为错误折叠态。免疫共沉淀证明重组CRD可特异性结合UGGT1，说明该构建体功能完整。

**重组功能性CRD中的二硫键模式与先前报道不同：**质谱分析显示重组CRD含有三个二硫键。肽图分析排除了先前文献报道的C10-C39、C21-C24、C42-C43配对方式，将可能性缩小至8种。

**CS-Rosetta区分二硫键配对模式：**基于主链化学位移的CS-Rosetta计算，仅C10-C42、C21-C43和C24-C39这一配对方式生成收敛的结构集合，而文献报道的配对方式不收敛，从而唯一确定了二硫键连接。

**CRD在溶液中形成亚微摩尔亲和力的二聚体：**天然质谱观察到单体和二聚体两种物种。¹⁵N弛豫实验估算全局旋转相关时间（τc）为7.4±0.5 ns，与5.7 kDa单体的预期值（~3 ns）不符，而与二聚体一致。稀释实验未观察到化学位移变化，表明二聚体在5–280 μM浓度范围内始终占主导，解离常数（Kd）<1 μM。

**CRD同源二聚体的溶液结构：**使用AriaWeb计算得到20个结构的集合，有序区（S5-E44）主链RMSD为0.32 ?。每个亚基折叠为三螺旋束，三个二硫键连接螺旋1/3和螺旋2/3。二聚体界面平均埋藏面积588±10 ?2，主要由疏水接触及loop1与螺旋2的相互作用构成。FoldSeek搜索未在PDB中发现同源结构，表明该折叠为新型折叠。

**分离的CRD结构在全长SEP15中保留：**将全长SEP15的HSQC谱与CRD和TRX结构域单独谱图叠加，各峰对应良好，表明全长蛋白在体外同样通过CRD形成二聚体，且两个结构域相互独立。

讨论部分指出，CRD结构确认了先前预测的UGGT1/SEP15复合物模型：UGGT1通过SEP15结合区（SBR）结合CRD，使SEP15的TRX结构域及C-G-U活性基序靠近UGGT1催化位点，提示SEP15可还原或异构化底物上的二硫键。尽管CRD在体外形成二聚体，但二聚体界面与UGGT结合界面高度重合，且体内SEP15始终与UGGT形成1:1复合物（ITC测得Kd=50 nM），同源二聚体Kd上限约1 μM，因此二聚体状态可能不具有生物学意义。关于二硫键配对与早期化学合成研究不同的原因，可能是后者在氧化复性过程中形成了动力学产物，而SHuffle菌株提供了生理相关的二硫键形成环境。研究结论：SEP15 CRD的NMR溶液结构揭示了一种由三个二硫键稳定的新型三螺旋折叠，该结构域在溶液中形成二聚体，其界面与UGGT结合界面一致；结果验证了UGGT/SEP15复合物模型，为未来研究SEP15与糖蛋白底物的相互作用及ER质量控制机制奠定了基础。