钙敏感受体C末端尾部β-arrestin募集必需残基缺失或致低钙血症

《Journal of Biological Chemistry》：Loss of residues required for β-arrestin recruitment in the calcium-sensing receptor C-terminal tail may contribute to hypocalcemia

　　

钙敏感受体（calcium-sensing receptor，CaSR）是C家族G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR），在钙稳态中发挥重要作用，其激活型突变可导致低钙血症。尽管该受体具有重要临床意义，且已有证据表明β-arrestin-1/2可调节CaSR信号转导，但CaSR中介导β-arrestin募集所需的具体残基以及β-arrestin在脱敏、转运和信号转导中的作用仍不明确。研究人员证实，受体激活后β-arrestin-1和β-arrestin-2均被募集至CaSR，且GPCR激酶（GPCR kinase，GRK）的缺失会损害β-arrestin募集。删除CaSR远端C末端尾部（该操作复制了低钙血症患者中发现的多种突变）可减少β-arrestin-1/2募集并增强受体信号转导。对受体胞质区域（胞内环和C末端尾部）的检测鉴定出三个丝氨酸和苏氨酸残基区域，这些区域与其他GPCR中的磷酸化编码相似。将上述每个残基突变为丙氨酸后表明，氨基酸1003-1011之间的一个区域对β-arrestin-1和β-arrestin-2募集均至关重要，而976-981残基之间区域的破坏则损害β-arrestin-2募集。这些残基的丙氨酸突变还增强了CaSR信号转导并损害受体内化，提示其在受体脱敏中发挥重要作用。在钙稳态紊乱疾病中报道的三个罕见编码变异定位于上述残基，其中T1006M和T1008P两个变异被证实可减少β-arrestin募集和CaSR内化并增强CaSR信号转导。因此，研究人员在CaSR C末端尾部鉴定出两个对β-arrestin募集、受体脱敏和内化至关重要的区域。这些区域内残基的突变可能构成低钙血症的又一发病机制。

一、研究背景与科学问题

钙敏感受体（calcium-sensing receptor，CaSR）属于C家族G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR），通过调节甲状旁腺激素释放和尿钙排泄来维持机体钙稳态。受体激活后主要通过G_q/11信号通路，激活磷脂酶C（phospholipase C，PLC）以增加三磷酸肌醇（inositol trisphosphate，IP₃）介导的胞内钙释放，并激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路，同时通过G_i/o降低环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平。对于多数GPCR，激活后由GPCR激酶（GPCR kinase，GRK）磷酸化受体胞内区域（胞内环或C末端尾部）的丝氨酸和苏氨酸残基，从而促进胞质β-arrestin（β-arrestin-1和β-arrestin-2）的募集。在经典模型中，β-arrestin募集可物理性阻断G蛋白偶联并促进网格蛋白介导的受体内化，即脱敏过程。然而，β-arrestin在CaSR脱敏、信号转导和内化中的具体作用尚存争议。早期研究认为β-arrestin对CaSR内化无促进作用，但2019年一项采用β-arrestin-1/2敲除细胞和动力学实验的研究表明，CaSR的组成型和激动剂介导的内吞均依赖β-arrestin-1和β-arrestin-2，但该研究未鉴定参与β-arrestin募集的CaSR具体残基。此外，不同磷酸化模式（磷酸化编码）可诱导β-arrestin不同构象，从而决定受体信号转导、脱敏和内化方式，但C家族GPCR的磷酸化模式研究相对匮乏。CaSR具有超过200个氨基酸的C末端尾部（残基865-1078），其远端截短突变可增强受体表面表达和下游信号转导，并与常染色体显性低钙血症（autosomal dominant hypocalcemia，ADH）相关。因此，明确CaSR C末端尾部中参与β-arrestin募集的具体残基及其在受体脱敏和内化中的作用，对于理解低钙血症的分子机制具有重要意义。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员采用多种关键技术方法开展研究。使用NanoBiT β-arrestin募集实验和生物发光共振能量转移（bioluminescence resonance energy transfer，BRET）实验检测CaSR激活后β-arrestin-1/2的募集；利用CRISPR-Cas基因编辑技术构建β-arrestin-1/2双敲除（HEK-βarr1/2-KO）细胞系；通过磷酸化位点预测软件鉴定CaSR胞质区域的潜在磷酸化位点；采用定点突变技术将预测的丝氨酸/苏氨酸残基突变为丙氨酸；使用Fluo-4钙成像实验和IP-1实验检测CaSR介导的胞内钙信号转导；构建N端血凝素（hemagglutinin，HA）表位和SNAP标签融合的CaSR质粒，结合结构照明显微镜（structured illumination microscopy，SIM）和全内反射荧光显微镜（total internal reflection fluorescence，TIRF）观察受体内化；利用旁观者BRET实验验证β-arrestin募集结果；在GRK2/3、GRK5/6及GRK2/3/5/6敲除细胞系中检测GRK对β-arrestin募集的调控作用；通过ClinVar数据库检索临床相关罕见编码变异并进行功能验证；采用蛋白质印迹（Western blot）检测细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）磷酸化水平。此外，研究人员还分析了四个公开的单细胞RNA测序数据集（包含人胎儿、人成体及恒河猴甲状旁腺非腺瘤细胞），以评估β-arrestin和GRK在甲状旁腺细胞中的表达情况。

三、研究结果

1. CaSR激活将β-arrestin-1和β-arrestin-2募集至细胞表面

在HEK-βarr1/2-KO细胞中，采用NanoBiT实验和BRET实验均证实CaSR激活后可募集β-arrestin-1和β-arrestin-2，其中β-arrestin-1的响应幅度更大，但两者的半数有效浓度（EC₅₀）无显著差异。单细胞RNA测序数据分析显示，人甲状旁腺细胞中β-arrestin-2表达高于β-arrestin-1，GRK5在胎儿和成体甲状旁腺细胞中表达较高，GRK1和GRK7不表达。

2. CaSR远端C末端尾部是β-arrestin-1和β-arrestin-2募集所必需

磷酸化位点预测软件鉴定出CaSR C末端尾部三个丝氨酸/苏氨酸富集区域：第一区域含七个预测磷酸化位点（S911、S912、S913、S915、S916、S918、S920），不符合已知磷酸化编码；第二区域（976-981，SLSFDE）符合PxPxxP/E/D磷酸化编码；第三区域（1003-1011）含四个预测磷酸化位点，同样符合PxPxxP/E/D编码。研究人员构建了Ser895Stop（895X）截短突变质粒，该突变删除了包含三个预测磷酸化位点的C末端尾部，但保留了Thr888残基。在亲本HEK293细胞中，895X突变显著增强了Ca²⁺_e和精胺（spermine）诱导的胞内钙信号，但在HEK-βarr1/2-KO细胞中无此差异，表明信号增强依赖于β-arrestin。NanoBiT实验证实895X突变显著降低了β-arrestin-1和β-arrestin-2的募集。

3. CaSR具有β-arrestin-1和β-arrestin-2募集的不同残基

对三个预测磷酸化区域内的丝氨酸/苏氨酸残基逐一进行丙氨酸突变。β-arrestin-1募集方面，第一区域和第二区域残基突变无显著影响，而第三区域三个残基（S1004、T1006、T1008）突变均降低β-arrestin-1募集，其中S1004A和T1008A的EC₅₀显著升高。β-arrestin-2募集方面，S918A突变显著降低募集幅度但不影响EC₅₀；第二区域S976A和S978A突变降低最大响应并升高EC₅₀；第三区域三个残基突变同样降低最大响应和EC₅₀。旁观者BRET实验进一步验证了上述结果，证实第三区域（1004-1008）对β-arrestin-1和β-arrestin-2募集均重要，而第二区域（976-978）主要参与β-arrestin-2募集。

4. CaSR磷酸化位点突变影响受体信号转导

在AdHEK细胞中，第二区域（S976A、S978A）和第三区域（S1004A、T1006A、T1008A）的丙氨酸突变显著增强了Ca²⁺_e和精胺诱导的胞内钙信号，EC₅₀显著降低，呈功能获得性表型。IP-1实验显示这五个突变同样增强了IP₃信号。在HEK-βarr1/2-KO细胞中，野生型与所有突变体的IP-1信号无差异，表明信号增强确实源于β-arrestin募集缺失而非G蛋白募集改变。

5. 第二和第三磷酸化位点突变影响CaSR内化

SIM成像和SNAP-647标记的定量内化实验表明，T1006A和T1008A突变显著降低激动剂驱动的CaSR内化，S978A突变也有小幅但显著的降低。在HEK-βarr1/2-KO细胞中，野生型CaSR的内化较亲本HEK293细胞受损，且三个突变体的内化率不再有显著差异，证实内化受损源于β-arrestin募集减少。细胞表面表达分析显示，S978A、T1006A和T1008A突变体的基础细胞表面表达显著升高。

6. CaSR两个区域对arrestin亚型募集具有差异效应且可能涉及不同GRK

在HEK-βarr1/2-KO细胞中过表达β-arrestin-1或β-arrestin-2可显著增强野生型CaSR的内化。对于1006A突变，两种β-arrestin亚型过表达均无法恢复内化；对于978A突变，β-arrestin-2过表达无法恢复内化，而β-arrestin-1过表达可增强内化，进一步证实第三区域对两种β-arrestin亚型均重要，第二区域主要参与β-arrestin-2募集。信号实验显示，在表达1006A的细胞中，两种β-arrestin过表达均无法降低Ca²⁺_i信号；而在表达978A的细胞中，仅β-arrestin-1可降低信号。GRK敲除实验表明，在GRK2/3/5/6四敲除细胞中，β-arrestin-1和β-arrestin-2募集均受损，内化显著降低；GRK2/3敲除降低β-arrestin-1和β-arrestin-2募集，而GRK5/6敲除仅降低β-arrestin-2募集，提示不同GRK可能磷酸化CaSR C末端尾部的不同区域。

7. 罕见编码变异损害β-arrestin募集并增强CaSR信号转导

通过ClinVar数据库检索，在预测磷酸化位点内鉴定出13个与钙稳态紊乱相关的罕见编码变异，涉及8个氨基酸。研究人员选择S1004C、T1006M和T1008P三个变异进行功能验证。结果显示，S1004C变异对β-arrestin-1/2募集和Ca²⁺_i信号均无影响；T1006M变异显著降低β-arrestin-1和β-arrestin-2募集并增强Ca²⁺_i信号（EC₅₀降低）；T1008P变异同样降低β-arrestin募集并增强信号。SIM成像和定量内化实验证实，1006M和1008P变异显著降低激动剂驱动和组成型内化，且该效应在HEK-βarr1/2-KO细胞中消失。ERK1/2磷酸化检测显示，上述变异和磷酸化位点突变均不影响pERK1/2水平。

四、讨论与结论

本研究证实CaSR C末端尾部含有多个对β-arrestin募集至关重要的残基。第二区域（976-981）和第三区域（1003-1011）符合PxPxxP/E/D磷酸化编码格式。第三区域残基突变同时损害β-arrestin-1和β-arrestin-2募集，而第二区域突变仅损害β-arrestin-2募集，提示不同β-arrestin亚型可能识别CaSR上不同的磷酸化编码，并可能以不同构象与受体结合。不同GRK可能磷酸化CaSR的不同区域，GRK2/3可能磷酸化第三区域，而GRK5/6可能磷酸化第二区域，这种GRK特异性磷酸化引导不同β-arrestin亚型募集的现象在GPCR中较为罕见。单细胞RNA测序分析显示甲状旁腺细胞中β-arrestin-2表达高于β-arrestin-1，提示生理条件下CaSR可能主要与β-arrestin-2偶联。β-arrestin募集可减少CaSR信号转导，符合经典GPCR脱敏模型。ERK1/2信号不依赖β-arrestin，可能由CaSR从内体持续信号转导产生。CaSR同时具有β-arrestin依赖性和非依赖性通路调节转运和信号转导。临床相关罕见变异T1006M和T1008P通过减少β-arrestin募集、损害受体内化并增强CaSR信号转导，可能构成低钙血症的又一发病机制。