《Journal of Biological Chemistry》：LIF and let die: Generation, mechanistical and structural characterization of bispecific antibodies triggering leukemia inhibitory factor (LIF) receptor activation independent of the cytokine LIF
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本文报道了单域抗体（sdAb）衍生的双特异性抗体的生成与表征，该类抗体通过触发由LIF受体（LIFR）和糖蛋白130（gp130）亚基组成的异二聚体受体的激动作用，模拟LIF的功能。为此，在骆驼科动物免疫后，通过酵母表面展示（YSD）鉴定了靶向LIFR的sdA
本文报道了单域抗体（sdAb）衍生的双特异性抗体的生成与表征，该类抗体通过触发由LIF受体（LIFR）和糖蛋白130（gp130）亚基组成的异二聚体受体的激动作用，模拟LIF的功能。为此，在骆驼科动物免疫后，通过酵母表面展示（YSD）鉴定了靶向LIFR的sdAb。所得的14个LIFR特异性互补位（paratopes）以双特异性抗体（bsAb）形式表达，所有bsAb均携带相同的靶向gp130的sdAb。在表达人LIFR及gp130的Ba/F3细胞上对bsAb进行功能分析，发现其中一个bsAb具有LIF样功能，其特征是诱导细胞增殖。冷冻电镜（Cryo-EM）结构分析显示，该bsAb靶向一个独特的LIFR表位，表明其形成的受体架构与先前报道的LIF信号复合物结构不同。此外，所鉴定的基于sdAb的双特异性LIF模拟物能够在天然表达LIF受体亚基的HeLa及TF-1细胞中诱导STAT3磷酸化。而且，通过抗体工程进一步提高了激动能力。总之，研究人员证明，利用sdAb作为构建模块可以模拟IL-6家族的细胞因子成员。
白血病抑制因子（LIF）是IL-6细胞因子家族成员，具有多效性，参与造血、免疫调节、胚胎发育及神经发育等多种生理过程。LIF通过结合由LIF受体（LIFR）和糖蛋白130（gp130）组成的异二聚体受体启动信号传导，导致JAK激酶交叉磷酸化并激活STAT转录因子。由于重组细胞因子存在半衰期短、生产过程复杂、脱靶毒性等局限性，基于抗体的细胞因子模拟物成为有前景的替代策略。然而，如何设计能够模拟天然配体功能并激活受体的抗体分子仍具挑战。本研究旨在利用单域抗体（sdAb）作为构建模块，生成双特异性抗体（bsAb），通过同时结合LIFR与gp130来模拟LIF的激动功能。
研究人员以3只骆驼科动物（雌性llama、雌性alpaca、雄性huarizo）免疫人LIFR胞外域（ECD），从外周血单个核细胞（PBMC）构建酵母表面展示（YSD）文库（约3.1×10
8克隆），经两轮荧光激活细胞分选（FACS）富集LIFR特异性VHH。采用可控Fab臂交换（cFAE）技术将LIFR特异VHH与gp130特异VHH组装成1+1双特异性抗体。功能评估使用Ba/F3-gp130:LIFR细胞增殖实验、HeLa和TF-1细胞的pSTAT3流式检测；结合特性采用生物层干涉法（BLI）；结构解析采用冷冻电镜（cryo-EM），并结合AlphaFold3等结构预测生成密度引导模型。
**通过骆驼免疫和YSD分离LIFR特异性VHH构建模块**：从免疫动物PBMC构建YSD文库，经两轮分选富集LIFR结合群体，测序获得172个独特VHH克隆，基于CDR3多样性选出28个进行表达。结果表明成功获得多样性的LIFR结合VHH。
**LIFR和gp130特异性sdAb衍生双特异性抗体触发强效LIF样受体激动**：经BLI评估，14个VHH-Fc蛋白结合人LIFR。利用cFAE技术将LIFR特异性VHH与gp130靶向VHH组装成双特异性抗体。在Ba/F3-gp130:LIFR细胞增殖实验中，分子#8呈剂量依赖性诱导细胞增殖，EC50在双位数pM范围，与LIF相当；竞争实验表明#8与LIF结合LIFR的不同表位，而其余13个LIFR结合剂无激动活性。这表明成功获得具有LIF样功能的双特异性抗体。
**Cryo-EM和分子建模研究解释工程化LIF模拟物的激动能力**：通过cryo-EM解析LIFR与激动性VHH#8和非激动性VHH#3的复合物，显示#8结合LIFR的D2结构域，#3结合D1/D2交界；gp130与抗gp130 VHH复合物表明该VHH结合gp130 D3，与LIF结合位点重叠。虽然分辨率约4–5 ?不足以构建可靠原子模型，但密度引导模型和2D类平均显示bsAb可同时结合两个受体亚基，形成与天然LIF:LIFR:gp130复合物（PDB:8v29）不同的受体几何排列。结论是精细表位决定激动活性，替代性受体构象仍可启动信号传导。
**抗体工程促进生成具有增强激动能力的sdAb衍生LIF模拟物**：设计了串联VHH（tandem）和隐藏IgG（hiIgG）等多价格式，并评估不同方向。在Ba/F3增殖实验中，四价tandemLIFRxgp130和hiIgGgp130xLIFR比亲本分子诱导更强增殖，而单向（one-armed）形式较弱或无效。BLI显示LIFR结合未被阻碍的方向更有效。结论是多价性和空间方向显著影响激动能力。
**工程化LIF模拟物在天然表达LIF受体的细胞系中促进STAT3磷酸化**：在HeLa和TF-1细胞中检测pSTAT3，结果与增殖实验一致，四价工程化分子在1 nM浓度下诱导明显的STAT3磷酸化，剂量反应显示hiIgGgp130xLIFR效力高于其单向变体。这表明工程化分子能在天然受体背景下激活下游信号。
在讨论中，研究人员指出，LIF在造血、免疫调节、胚胎发育等过程中发挥作用，是多种疾病治疗的潜在靶点。重组细胞因子可能诱导抗药抗体等风险，而抗体基模拟物不共享内源细胞因子序列，可降低该风险。本研究展示的bsAb诱导的受体排列虽与天然LIF复合物几何结构不同，但仍能有效激活JAK-STAT信号，提示LIFR:gp130异二聚体在胞外排列上具有一定灵活性。此外，非激动性VHH#3结合LIFR D1/D2交界，而激动性VHH#8靶向D2，说明精细表位是区分激动与非激动的关键。抗体工程实验表明，多价性和空间方向能增强激动能力。研究结论：本工作将LIF添加到可用sdAb衍生双特异性抗体模拟的IL-6家族细胞因子列表中，并证明格式架构对激动能力具有显著影响。
