肝细胞丝氨酸棕榈酰转移酶3（SPTLC3）维持线粒体非经典神经酰胺稳态并调控电子传递链（ETC）功能

《Journal of Biological Chemistry》：Hepatocyte Serine Palmitoyltransferase 3 is essential for mitochondrial ceramide homeostasis and electron transport chain function

　　

鞘脂（sphingolipids）构成必需膜脂，也作为信号分子介导基本细胞过程。组成性鞘脂代谢紊乱促进一系列代谢性疾病。鞘脂生物合成由丝氨酸棕榈酰转移酶（serine palmitoyltransferase, SPT）启动，该酶是由Sptlc1与Sptlc2或特征较少的亚基Sptlc3组成的异聚体酶。虽然经典Sptlc1/Sptlc2复合体生成大多数鞘脂，Sptlc1/Sptlc3产生非经典鞘脂，其功能仍知之甚少。Sptlc3表达在小鼠模型和人类肝病中增加，但其生物学作用仍不清楚。为探讨这一问题，研究人员构建了肝特异性SPTLC3敲除（SPT3-hKO）小鼠模型。SPTLC3缺失导致肝细胞严重线粒体功能障碍，特征为耗氧量降低、ATP生成减少、NADH/NAD⁺比值升高并伴随糖酵解活性增加。机制上，研究人员发现电子传递链（electron transport chain, ETC）缺陷并非源于ETC复合体的内在损伤，而更可能源于复合体I与复合体III之间的电子流受阻，原因可能是辅酶Q（Coenzyme Q）可利用性降低。虽然在肝匀浆中测定时非典型神经酰胺占比约～4%，但在富集线粒体组分中测定显示该细胞器富集这些非典型神经酰胺。总之，研究人员的发现确定SPTLC3是线粒体神经酰胺组成和ETC功能的关键调节因子，揭示非经典鞘脂在肝细胞能量代谢中的专门作用。意义声明：鞘脂介导基本细胞过程，但Sptlc3（其促进非经典鞘脂合成）的影响仍很大程度上未探索。研究人员工作强调Sptlc3在肝脏中的功能，建立非典型脂质种类与肝细胞线粒体生物能量学之间的新联系。使用肝特异性敲除小鼠模型，研究人员证明Sptlc3特异性促进线粒体神经酰胺组成、CoQ₉可利用性和高效电子传递链（ETC）活性。与心肌细胞中SPTLC3缺失损害复合体I内在活性不同，肝细胞线粒体保留酶完整性，但因脂质组成改变而显示功能输出受损。这些发现揭示Sptlc3通过神经酰胺依赖机制调节线粒体能量代谢的前所未知作用，并强调生物活性鞘脂亚细胞区室化的重要性。

研究背景：鞘脂（sphingolipids，SLs）是细胞和细胞器膜的结构成分，也是介导真核细胞多种过程的生物活性脂质。鞘脂生物合成起始于丝氨酸棕榈酰转移酶（serine palmitoyltransferase，SPT），其催化核心由Sptlc1与Sptlc2或Sptlc3组成。经典Sptlc1/Sptlc2复合体生成大多数鞘脂，而Sptlc1/Sptlc3生成非经典鞘脂，其生物学意义长期不清。Sptlc3在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）向肝细胞癌（HCC）进展、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）等肝病中上调，但作用不明。肝细胞占肝脏质量70–80%，线粒体丰富，线粒体功能障碍参与多种肝病。神经酰胺和鞘氨醇-1-磷酸等鞘脂可调节线粒体动力学、生物能量、死亡和形态。研究人员此前发现心肌细胞SPTLC3缺失导致复合体I内在酶缺陷，并鉴定出与复合体I接触的乳糖神经酰胺。当前研究旨在探讨肝细胞特异性SPTLC3在肝细胞鞘脂代谢和线粒体功能中的作用，并建立肝细胞特异性SPT3-hKO小鼠模型。

研究开展与意义：研究人员构建肝细胞特异性SPTLC3敲除小鼠，发现SPTLC3缺失导致肝细胞线粒体功能障碍、超微结构异常、ETC复合体I至III电子传递受损、线粒体非典型神经酰胺减少和CoQ₉降低。研究结论表明，SPTLC3来源非经典鞘脂是肝细胞线粒体神经酰胺组成和ETC功能必需的非冗余调节因子，其作用不同于SPTLC1/SPTLC2经典鞘脂池，并揭示器官和细胞器特异性的鞘脂-线粒体生物能量学联系。

关键技术方法：研究人员建立肝细胞特异性SPT3-hKO小鼠，即SPTLC3 floxed小鼠（由Dr. David Montefusco创建）与Alb-cre交配；原代肝细胞用于表型分析。人永生化胎儿肝细胞HC3716-hTERT（来源于Dr. Devanand Sarkar实验室）用于SPTLC3和SPTLC2的siRNA敲低。主要技术包括RNA-seq与GO富集、Seahorse线粒体压力/糖酵解速率测试、Oroboros高分辨呼吸测定、冻融线粒体ETC底物呼吸、蓝白非变性电泳、ETC复合体及连接活性测定、LC-MS/MS靶向/非靶向脂质组学、CoQ₉/CoQ₁₀定量、TEM、qPCR线粒体DNA、流式MitoTracker Green/TMRE、FRAP、线粒体分离和免疫共沉淀质谱。

研究结果：
SPTLC3缺失损害线粒体功能和超微结构。免疫印迹显示SPT3-hKO原代肝细胞Sptlc3水平极低，SPTLC1和SPTLC2表达不变；SPTLC1共免疫沉淀质谱显示SPTLC2是主要结合伙伴，同时存在较少但可重复的SPTLC1/SPTLC3复合物。RNA-seq肝匀浆的GO富集显示呼吸链复合体、线粒体膜、电子传递链和氧化磷酸化等通路差异。Seahorse显示SPT3-hKO原代肝细胞耗氧率（OCR）在基础呼吸、最大呼吸、ATP产生和质子漏中降低，最大解偶联呼吸差异最显著；糖酵解基础率和代偿率近10倍增加，线粒体OCR/糖酵解比降低。TEM显示SPT3-hKO线粒体嵴受损，40,000倍下几乎不可见，线粒体面积增加、嵴密度降低；线粒体DNA含量和MitoTracker Green流式线粒体计数增加。结论：Sptlc3为线粒体氧化和ATP产生所需，缺失导致功能和形态缺陷，线粒体数量增加可能为代偿。

Sptlc3对电子传递链至关重要。Oroboros原代肝细胞显示复合体I和复合体IV活性缺陷。为区分TCA循环与复合体I缺陷，研究人员使用冻融富集线粒体进行Seahorse：NADH为复合体I底物时SPT3-hKO耗氧显著降低；琥珀酸为复合体II底物时呼吸相当，提示复合体II可绕过复合体I恢复下游活性。SPT3-hKO肝细胞ATP降低，NADH/NAD⁺升高。蓝白非变性电泳显示复合体I天然表达和超复合体形成无差异。去垢剂溶解线粒体的活性测定中，复合体II和复合体IV活性无显著差异；外源CoQ存在时复合体I酶活性可完全发挥；复合体I-III连接活性显著降低，复合体II-III连接活性不变。CoQ₉在小鼠肝脏中最丰富，SPT3-hKO线粒体中显著降低，CoQ₁₀无显著差异。结论：缺陷来自复合体I至III电子传递受阻，可能因CoQ₉可利用性降低。

人肝细胞SPTLC3敲低重现小鼠肝细胞线粒体缺陷。在HC3716细胞中，siRNA敲低SPTLC3而非SPTLC2，降低基础呼吸、最大呼吸、ATP产生和备用呼吸容量；SPTLC3敲低增加线粒体DNA和MitoTracker Green信号，降低TMRE标记的线粒体膜电位；SPTLC2敲低无这些影响。FRAP显示SPTLC2和SPTLC3敲低均增加荧光恢复时间，提示鞘脂整体调节线粒体内膜（IMM）流动性，但只有SPTLC3缺失导致ETC缺陷。结论：Sptlc3特异维持线粒体功能，Sptlc2不关键；膜流动性改变可能不是Sptlc3特异ETC缺陷的主因。

Sptlc3缺失特异性影响线粒体神经酰胺。脂质组学在肝匀浆和富集线粒体中进行。免疫印迹确认线粒体富集，但存在Calreticulin提示的内质网污染且两组相当。全肝匀浆PCA仅部分分离，主要脂类热图聚类不明显；线粒体PCA分离更强，热图聚类明显。SPT3-hKO线粒体不仅鞘脂如鞘氨醇改变，甘油酯、甘油磷脂和甘油三酯也改变；心磷脂谱相似，双溶血心磷脂不同。靶向鞘脂组学显示，全肝匀浆中SPTLC3缺失未减少非典型碱基神经酰胺，反而d18和d19标准神经酰胺增加；富集线粒体中，非典型神经酰胺较对照减少约50%，d18神经酰胺减少10–15%。d17神经酰胺在线粒体中最丰富，多数d17碱基神经酰胺显著降低；d16尤其超长链种类降低，d19和d20不变；d18神经酰胺也轻度降低。结论：Sptlc3来源神经酰胺集中在线粒体，并支持复合体I-III电子传递和ATP产生。

讨论部分总结：该研究首次建立Sptlc3在肝细胞线粒体呼吸、形态和功能完整性中的关键作用。此前心肌细胞SPTLC3缺失导致复合体I内在酶缺陷，而肝脏中复合体I保留内在活性但电子传递功能受损，显示器官特异性差异。复合体I是ETC最大组分，贡献近半质子动力势，是电子传递入口和限速步骤，维持NAD⁺/NADH比值。SPT3-hKO小鼠基础条件下无明显表型或肝损伤，提示尽管复合体I活性降低仍可维持正常肝功能；但高能量需求或细胞应激如HCC时可能不同。SPTLC3缺陷肝细胞通过增加糖酵解补偿能量。复合体I活性下降不直接与复合体I酶功能下降或超复合体形成受损相关。可能机制包括线粒体CoQ₉降低，以及线粒体d17神经酰胺缺失改变膜环境而阻碍复合体I至复合体III电子流。心磷脂是IMM核心结构功能成分，支持嵴结构、稳定呼吸链超复合体并直接与复合体I、III、IV相互作用；本研究定义Sptlc3来源非典型鞘脂在线粒体生物能量学中的新功能，其直接或间接作用及双向关系仍待研究。讨论还提到，SPTLC3表达在HCC细胞系HepG2和Huh7中相对非转化肝细胞系HC3716升高，SPTLC3敲低选择性降低癌细胞系活力而不影响HC3716，提示HCC细胞可能选择性依赖SPTLC3。

研究结论翻译：总体而言，本研究对肝脏SPTLC3的探索揭示，在肝细胞中，Sptlc3依赖鞘脂对维持线粒体膜非典型神经酰胺组成至关重要，该组成支持复合体I高效电子传递，其缺失导致ATP产生减少并伴随代谢向糖酵解转变。这与研究人员此前心肌细胞研究形成对比，后者sptlc3缺失导致复合体I内在缺陷而非电子流改变，尽管线粒体氧化下降和代偿性糖酵解增加相似。复合体I受损机制在心肌细胞和肝细胞中的差异表明细胞类型特异性机制。此外，此前研究鉴定出与心肌细胞复合体I相关的乳糖神经酰胺，而本研究中未发现，提示不同器官线粒体膜脂组成不同。这些组织特异性差异强调靶向生物活性鞘脂进行代谢调节和疾病治疗时需考虑器官和细胞器特异性。鉴于肝细胞癌细胞常重编程脂质和线粒体代谢以支持增殖，未来方向是SPTLC3在肝癌中的作用。研究人员发现SPTLC3表达在肝细胞癌细胞系HepG2和Huh7中相对非转化肝细胞系HC3716升高，SPTLC3敲低选择性降低癌细胞系活力而不影响HC3716，提示HCC细胞可能选择性依赖SPTLC3，可能支持其升高能量需求；该癌症背景下SPTLC3的详细机制和线粒体特征正在另一篇手稿中研究。综上，研究人员的发现确定SPTLC3来源非典型鞘脂是肝细胞线粒体神经酰胺组成和电子传递链功能必需的非冗余调节因子，其来源和作用不同于SPTLC1/SPTLC2产生的经典鞘脂池。鉴于肝脏在全身脂质和能量稳态中的中心地位，这些发现确立SPTLC3作为连接鞘脂代谢与线粒体生物能量学的前所未知节点，其相关性从肝脏代谢疾病延伸至肝细胞癌。